$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת הפתרון
- הכנת תמיסה חוץ-תאית S1: 4-(2-הידרוקסי-אתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית (HEPES) תמיסה חוץ-תאית חוצצת המכילה (ב-mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7.3 (מותאם עם NaOH); אוסמולריות = 300 mOsm (מותאם עם גלוקוז).
- הכינו תמיסה חוץ-תאית S2: תמיסה חוץ-תאית מחומצנת קרבוגן (95% O2, 5% CO2) המכילה (ב-mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES); pH = 7.3; אוסמולריות = 300 mOsm (מותאם עם גלוקוז).
- הכינו תמיסת אגרוז בטמפרטורה נמוכה 4% (S3) להטמעת רקמות: אגרוז בטמפרטורה נמוכה של 4%. ממיסים 2 גרם אגרוז בעל ג'ל נמוך ב-50 מ"ל של S1 בבקבוק מעבדה מזכוכית של 100 מ"ל יחד עם מערבל מגנטי. כדי להמיס את האגרוז, הכניסו את הבקבוק לאמבט מים (כשהמכסה לא סגור היטב) בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות או עד שהתמיסה הופכת לשקופה תוך כדי ערבוב. יש להתקרר ולשמור אגרוז מומס באמבט מים שני בטמפרטורה של 42°C עד לשימוש נוסף.
- הכנת תמיסה תוך-תאית S4: תמיסת פיפטה המכילה (ב-mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 0.3 CaCl2 (חופשי Ca2+ = 110 ננומטר), 10 HEPES, 2 אדנוזין 5′-טריפוספט מלח מגנזיום (MgATP), 1 גואנוזין 5′-טריפוספט מלח נתרן (NaGTP); pH = 7.1 (מותאם עם KOH); אוסמולריות = 290 mOsm.
- לשנות/להתאים את ההרכב של S1, S2 ו-S4 בהתאם לתכנון ניסיוני אינדיבידואלי (למשל, חוסמים פרמקולוגיים לבידוד סוגים מסוימים של זרמים מופעלי מתח).
2. VNO דיסקציה והטבעה
- יש להקריב בעלי חיים על ידי חשיפה קצרה ל-CO2 ולערוף את ראשו באמצעות מספריים כירורגיים חדים. הערה: מכיוון שהזמן מהקרבת בעל החיים ועד להנחת כמוסת VNO על קרח הוא קריטי, מזערו את הזמן לפחות משתי דקות. כדי לשמור על כדאיות הרקמות, הטמע את שני ה-VNO שנחתכו במלואם באגרוז תוך פחות מ-30 דקות.
- הסר את הלסת התחתונה עם מספריים כירורגיים גדולים. נכנסים דרך חלל הפה וחותכים את עצמות הלסת ואת השריר של כל צד בנפרד.
- מניחים את החלק הנותר של הראש הפוך בצלחת פטרי גדולה.
- משכו את עור הלסת העליונה וסביב קצה האף עם מלקחיים בינוניים כדי לקבל גישה טובה יותר לשיניים החותכות.
- השתמשו במספריים לעצם כדי לחתוך את החלק הגדול ביותר של החותכות בזווית ~45° בכיוון הרוסטרלי (איור 1A). זה יקל על הסרת קפסולת VNO מחלל האף.
הערה: אין לחתוך לשורש השן כדי למנוע נזק לקצה קפסולת VNO.
- תפסו את החיך העליון הנוקשה בחלק הרוסטרלי שלו בעזרת מלקחיים בינוניים וקלפו בזהירות בחזרה בחתיכה אחת בזווית שטוחה (איור 1B).
הערה: יש לשטוף שוב ושוב עם S2 קר כקרח.
- השתמשו במספריים מיקרו קפיציים כדי לחתוך את האיחוי הגרמי בין קצה עצם הוומר לבין הלסת. הכנס את קצות המספריים כאשר החלק המעוגל של הקצה מצביע כלפי חוץ הרחק מה- VNO וחתך בזהירות את העצם בצעדים קטנים הן בצד שמאל והן בצד ימין לרוחב לכמוסת VNO.
- כדי להסיר את קפסולת VNO, השתמש מספריים micro קפיץ לחתוך דרך עצם vomer בחלק caudal בזהירות להרים את עצם vomer מתוך חלל האף באמצעות מלקחיים בינוניים. מיד להעביר את VNO צלחת פטרי קטן תחת מיקרוסקופ סטריאו על חבילת ג'ל קרח שבו השלבים הנותרים של הדיסקציה יבוצעו.
- שטפו את ה-VNO בכמות קטנה של S2 קר כקרח כדי למנוע מהרקמה להתייבש.
- הפרידו את הכמוסות הסחוסיות המכילות את הרקמות הרכות VNO על ידי תפיסת החלק האחורי של עצם הוומר במלקחיים בינוניים. מקמו את הקפסולה לתצוגה גבית כך שייראה פיצול בין שני ה-VNOs (איור 1Di).
- השתמש בקצה המלקחיים העדינים כדי להפריד את שתי כמוסות הסחוס VNO מהעצם המרכזית תוך שמירה על עצם הוומר נעוצה בחלק האחורי.
הערה: השתמשו במלקחיים רק בשולי קפסולת הסחוס והיזהרו מאוד שלא לחדור דרך הסחוס מכיוון שהאפיתל התחושתי העדין ניזוק בקלות.
- לאחר הפרדת שני ה-VNOs, התחילו להסיר את הסחוס העוטף את ה-VNO הראשון.
- תופסים את השפה העליונה של הקפסולה במלקחיים עדינים ומפצלים את דופן הסחוס שהייתה מחוברת קודם לכן לעצם הוומר (הצד המדיאלי).
- כדי להסיר את שאריות הסחוס, סובבו את ה-VNO עם הצד הצידי המעוגל שלו לתחתית הצלחת ונעצו היטב את הסחוס בצד אחד באמצעות מלקחיים. הזיזו בזהירות את המלקחיים העדינים השניים מהצד האחורי בזווית שטוחה מאוד בין הסחוס ל-VNO כדי לשחרר את הקשר בין הרקמה לסחוס.
- קלף באיטיות את VNO מן הסחוס על ידי החזקתו בקצה הקאודלי שלה, כדי למנוע פגיעה אפיתל חושי.
- לאחר הורדת ה-VNO מהקפסולה, הקפידו להסיר את כל חלקי הסחוס הקטנים שנותרו, שכן כל פיסת סחוס שנותרה תנתק את הרקמה מהאגרוז שמסביב במהלך תהליך החיתוך.
- הניחו טיפה קטנה של S2 קר כקרח על ה-VNO הראשון שנותח כדי למנוע נזק לרקמות. כלי דם גדול בצד הלטרלי ייראה לעין, מה שמעיד על כך שהאיבר עדיין שלם ולא נפגע בצורה חמורה במהלך הדיסקציה (איור 2A,ii). במקרה שכלי הדם נפגע, עדיין יהיה כדאי להמשיך לחתוך את ה- VNO כל עוד המורפולוגיה הכוללת לא נפגעה בבירור.
- מיד לנתח את VNO השני.
- כדי להטמיע את ה-VNOs, מלאו את שתי צלחות הפטרי הקטנות עד לשפה ב-S3 מומס (מאוחסן באמבט מים בטמפרטורה של 42°C; ראו 1.3).
- החזק את ה- VNO בקצה הקאודלי הרחב יותר עם מלקחיים עדינים כדי למנוע נזק לאפיתל התחושתי.
- לטבול את VNO באגרוז ולהזיז אותו אופקית קדימה ואחורה מספר פעמים כדי להסיר את הסרט של פתרון חוץ-תאי, כמו גם כל בועות אוויר מפני השטח שלה.
- מקמו את ה-VNO אנכית כשהקצה הקאודלי פונה לתחתית המנה. במקום לצבוט את ה-VNO עם המלקחיים ישירות, התאימו את הכיוון על ידי הזזת קצה המלקחיים בסמיכות ל-VNO.
הערה: ההתמצאות במהלך ההטבעה היא קריטית מכיוון שהיא קובעת את מישור הפרוסה ואת הנגישות לנוירונים חושיים במהלך הניסוי.
- מניחים את הכלים על אריזת קרח ג'ל ומחכים עד שהאגרוז יתמצק.
הערה: אין לשנות את כיוון ה-VNO ברגע שהאגרוז החל להתמצק מכיוון שהדבר ינתק את הרקמה מהאגרוז שמסביב.
3. חיתוך רקמות VNO קורונלי
- השתמשו במרית קטנה כדי להסיר גוש אגרוז מהתבשיל הקטן לתוך מכסה של צלחת פטרי גדולה, הפכו את האגרוז הפוך והותירו את הקצה הקאודלי של ה-VNO פונה כלפי מעלה.
- חותכים את הבלוק לצורה פירמידלית באמצעות אזמל כירורגי (3-4 מ"מ בקצה, 8-10 מ"מ בתחתית). יש להקפיד שלא לפגוע ברקמה המוטבעת.
- השתמש דבק סופר כדי לקבע את הבלוק בצורת פירמידה למרכז צלחת הדגימה vibratome ולחכות ~ 1 דקות עבור דבק להתייבש לחלוטין.
- מעבירים את צלחת הדגימה לתא החיתוך ומכינים את ה- VNO השני, בהתאם. יש לשמור את הצלחת עם הדגימה השנייה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
- השתמש במיקרוטום להב רוטט עם ההגדרות הבאות: עובי: 150-200 מיקרומטר; מהירות: 3.5 a.u. = 0.15 מ"מ/שנייה; תדר: 7.5 a.u. = 75 הרץ. מעבירים פרוסות לתא חמצון עד לשימוש לאחר בדיקה קצרה של מורפולוגיית הפרוסה תחת המיקרוסקופ המנתח. פרוסות ניתן לשמור במשך כמה שעות.
4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות חד-תאיות
- להקלטות, השתמש במיקרוסקופ זקוף בעל שלב קבוע המצויד במטרות טבילה במים, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית דודט או אינפרא אדום (IR-DIC) ואפיפלואורסצנטיות, כמו גם במצלמת מכשיר מצמיד מטען מקורר (CCD). לרכישת נתונים, השתמש במגבר מהדק תיקון, במת ראש, לוח ממשק אנלוגי לדיגיטלי / דיגיטלי לאנלוגי (AD/DA) ומחשב (כולל תוכנת הקלטה).
- הכינו מלאי של 10-20 פיפטות תיקון (4-7 MΩ). משוך פיפטות מנימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.50 מ"מ [OD]/קוטר פנימי 0.86 מ"מ [ID]) באמצעות מושך מיקרופיפטה ופוליש אש עם microforge.
הערה: ליטוש אש של קצות פיפטה הוא קריטי בעת תיקון VSN קטנים למדי. זה יעזור למנוע קרע את קרום התא בעת הפעלת לחץ שלילי על מנת להשיג חותם התנגדות גבוהה. לאחר ליטוש פתח פיפטה צריך להיות כ 1 מיקרומטר.
- יש לשמור פיפטות בצנצנת אחסון פיפטה כדי למנוע נזק והצטברות אבק עד לשימוש.
- הכנת מערכת זילוח על ידי מילוי מאגרי תמיסה וצינורות על פי תכנון ניסיוני.
הערה: הסר בועות אוויר מצינורות לחלוטין מכיוון שהן יפריעו מאוד לרישומים אלקטרופיזיולוגיים.
- התאם את הלחץ כדי להשיג זרימה ~ 3 מ"ל/דקה.
הערה: לחצים גבוהים יגרמו לתזוזה של פרוסת הרקמה וכן להפסקת רישומים אלקטרופיזיולוגיים.
- העבירו פרוסת VNO לתא הדמיה וקיבעו את מיקום הפרוסה באמצעות עוגן נירוסטה מחווט בסיבים סינתטיים בעובי 0.1 מ"מ (איור 2B-C).
הערה: אין לכסות את פרוסת הרקמה באחד מחוטי הסיבים הסינתטיים אלא באגרוז המקיף את הפרוסה.
- העבירו את תא ההדמיה למערך ההקלטה ומזגו ברציפות פרוסות עם S2 מחומצן בטמפרטורת החדר באמצעות יישום אמבטיה.
- התאימו את נימי היניקה לפני השטח של התמיסה כדי ליצור יניקה איטית להחלפה מתמדת של תמיסת אמבטיה. התאימו את "עיפרון הזלוף" הרב-קני 8 ב-1 מעל וקרוב לחלק הלא-חושי של פרוסת VNO שמכילה את כלי הדם (איור 2C, 3A). זה יהיה מועיל לסדר עיפרון זילוח פיפטה הקלטה להיות מול הפרוסה מכיוונים מנוגדים.
- חבר אלקטרודת ייחוס ותמיסת אמבטיה באמצעות גשר אגר בצורת L (מלא ב- KCl 150 mM).
- מלא פיפטה תיקון עם פתרון פיפטה S4.
- הרכיבו את הפיפטה מעל אלקטרודת המדבקה הכסופה המצופה כלוריד המחוברת לשלב הראש מבלי לגרד את הציפוי ונצמדו היטב.
- יש להפעיל לחץ חיובי קל (כ-1 מ"ל על מזרק פלסטיק של 10 מ"ל) על פיפטת המדבקה לפני הכניסה לאמבטיה.
- הורידו את הפיפטה לתוך האמבטיה באמצעות מיקרו-מניפולטורים מספיק רחוק כדי להיות מסוגלים להטביע את המטרה מבלי לפגוע בה (איור 2D).
- ניטור עמידות פיפטה (R pip, בין 4-7 MΩ) באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה המחוברת לשלב הראש.
הערה: אםפיפס R הוא <4 MΩ קצה הזכוכית נשבר. אם פיפס R הוא >10 MΩ, סביר להניח שהקצה סתום ויש להחליף את הפיפטה.
- דמיינו את פרוסת VNO עם מצלמת CCD באמצעות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ממוטבת אינפרא אדום (DIC) וזהו FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: רצף הקשור לקולטן פפטיד פורמיל 3) המבטא תאים (או נוירונים בעלי תווית דומה) באמצעות תאורה פלואורסצנטית וקוביית מסנן מתאימה.
- מקדו ומקדו תאים פלואורסצנטיים או לא פלואורסצנטיים בהתאם לתכנון הניסוי.
- כדי להתקרב לגוף התא, השתמש בגלגלי יד לרגישות מרבית. בשל לחץ חיובי, שקע קטן בקרום הסומה של התא הופך גלוי ברגע שקצה פיפטה נמצא בקרבת מקום.
- שחררו לחץ חיובי והפעילו לחץ שלילי קל כדי למצוץ את קרום התא על מנת להשיג אטם התנגדות גבוה (1-20 GΩ). יש להפעיל יניקה קצרה ועדינה כדי לשבש את קרום התא ולבסס את תצורת התא כולו.
- נטר התנגדות גישה כל הזמן במהלך experiment.
הערה: כוללים רק תאי עצב המפגינים התנגדות גישה קטנה ויציבה (≤3%מקלט; שינוי <20% במהלך הניסוי) לאנליזה.
