ניטור קליפת המוח באמצעות מערך אלקטרודות מרובות בתגובה לגורמים הגורמים להתקפים

תקציר

מקור: Lu, H. C., et al. גירוי זרם ישיר ורישום מערך רב אלקטרודות של פעילות דמוית התקף בהכנת פרוסות מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016).

בסרטון זה נחקרות ההשפעות של גירוי זרם ישיר טרנס-גולגולתי (tDCS) על פרוסות מוח המכילות את פיתול החגורה הקדמי (ACC) ואת אזורי התלמוס, תוך שימוש במערך רב-אלקטרודות (MEA) למדידת אותות חשמליים. על ידי העברת פולסים חשמליים ועירוי תרופות הגורמות להתקפים, המחקר חוקר את תגובת ACC להתקפים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנת תמיסה ניסיונית וציוד להקלטת MEA (Multielectrode Array)

1. הכן נוזל שדרה מוחי מלאכותי (aCSF; 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₃, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃ ו- 10 mM גלוקוז, מבעבע עם 95% O₂ ו- 5% CO₂).
2. השתמש בשני סוגים של בדיקות MEA: 6 x 10 מישורי MEA ו- 8 x 8 MEA. הגשושית הראשונה מכסה את האזור הכולל את קליפת המוח, הסטריאטום והתלמוס. הבדיקה האחרונה מכסה רק את האזור קליפת המוח.
3. השתמש במגבר של 60 ערוצים עם מסנן פס המוגדר בין 0.1 הרץ ל- 3 קילוהרץ בהגברה של 1,200. קבל נתונים בקצב דגימה של 10 kHz.
4. הניחו שני חוטי כסף מצופים AgCl בתוך תא MEA עבור DCS (גירוי זרם ישיר). לאחר מכן, השתמש בחוטי הכסף המצופים ב- AgCl כדי לייצר שדות חשמליים שנוצרו על ידי ממריץ מבודד.
5. הניחו אלקטרודת טונגסטן (קוטר, 127 מיקרומטר; אורך, 7.62 ס"מ; קצה מחודד 8° AC; התנגדות, 5 MΩ) לגירוי תלמי, והניחו את אלקטרודת הייחוס בתא MEA. העבירו את זרמי אלקטרודת הטונגסטן באמצעות ממריץ מבודד שנשלט על-ידי מחולל פולסים (איור 1).

2. הכנת פרוסת המוח

1. יש להשתמש בעכברי C57BL/6J זכרים, בני 4-8 שבועות. שכן את בעלי החיים בחדר ממוזג (21-23 מעלות צלזיוס; 50% לחות; 12 שעות / 12 שעות מחזור אור/חושך, אורות דולקים בשעה 08:00) עם גישה חופשית למזון ומים.
2. קח aliquot 250 מ"ל של aCSF מוכן בשלב 1.1 ומניחים אותו בתוך מלאה קרח. במקביל, לספק גז רציף המורכב 95% O₂ ו 5% CO₂.
3. כירורגיה
   1. מרדימים את בעל החיים עם 4% איזופלורן בקופסת זכוכית למשך כ-3 דקות. ברגע שהחיה מגיעה לעומק כירורגי של הרדמה (מסומן על ידי היעדר תגובה לצביטת בוהן), הניחו אותה על מגש רדוד מלא בקרח כתוש והסירו את הראש באמצעות מספריים.
   2. חושפים את הגולגולת וחותכים את השריר שנותר. לאחר מכן, באמצעות rongeurs, לקלף את פני השטח הגבי של הגולגולת מן המוח. חותכים את צידי הגולגולת באמצעות רונגורים. לעקר את כל כלי הניתוח בתמיסת אתנול 75%.
   3. באמצעות מרית, לחתוך את נורות הריח ואת הקשרים העצביים לאורך פני השטח הגחוני של המוח ולהסיר את המוח. לאחר עריפת ראש, ולהעביר במהירות את המוח לכוס מלאה aCSF מחומצן קר כקרח.
4. הכנת תלמוס מדיאלי (MT)-ACC (פיתול החגורה הקדמי) פרוסת מוח
   הערה: הכנת פרוסות המכילות את המסלול מה- MT ל- ACC
   1. חתכו ביד את גוש המוח עם שני חתכים סגיטליים 2.0 מ"מ לרוחב לקו האמצע בכל חצי כדור כדי להציג את האנטומיה התת-קליפתית. לאחר מכן, בצע שני חתכים זוויתיים. בצע את החתך הצולב, הראשון במקביל למערכת הסיבים הנראית לעין בסטריאטום.
   2. בצע את החתך הצולב, השני, מהחיבור בין המוח הקטן לקליפת המוח הראייה, לנקודת האמצע בין הקומיסורה הקדמית לבין מערכת הראייה, שהן גחון ומקבילות למסלול התלמוסינגולט.
   3. חבר את בלוק המוח לצלחת זוויתית (~ 120 °) עם דבק ציאנואקרילט ובצע חתך ממש מעל נקודת המפנה של המסלול. פתחו את הצלחת, שטחו אותה והדביקו אותה על במת התא של הוויברטום.
   4. הכינו פרוסות מוח תלמוס-ACC מדיאלי (בעובי 500 מיקרומטר) ולאחר מכן טבלו אותן ב-aCSF מחומצן קר כקרח.העבירו פרוסות לתא ההקלטה ושמרו בטמפרטורה של 32°C תחת זילוח רציף (12 מ"ל/דקה) עם aCSF מחומצן למשך שעה.

3. הכנת תא זילוח להקלטת מערך ריבוי אלקטרודות

1. הכנת תא זילוח
   1. הניחו גשושית MEA על מערכת רב-ערוצית, והשתמשו בשתי שפופרות פוליאתילן נפרדות כדי לחבר את הגשושית למשאבה פריסטלטית. השתמש בצינור אחד כדי להנחות את ה- aCSF לתוך תא MEA ובצינור השני כדי להנחות את ה- aCSF אל מחוץ לתא. לבסוף, יש לנקב ברציפות את התכשיר עם aCSF מחומצן חם (29-30 מעלות צלזיוס) (8 מ"ל/דקה).
2. העבירו את פרוסת המוח ל-MEA. החזיקו את פרוסת המוח באזור המזרח התיכון וצפון אפריקה בעזרת צמר גפן רטוב. הזיזו בזהירות את פרוסת המוח כדי לוודא שה-ACC מכוון מעל האלקטרודות.
3. השתמשו בערכות עיגון פרוסות ובהחזקות כדי ללחוץ על פרוסת המוח. שלב זה מבטיח חיבור חשמלי טוב בין הפרוסה לאלקטרודות.

4. יצירת שדות חשמליים על ידי DCS

הערה: הגדרת כיוון השדה החשמלי התבססה על כיוון הציר האקסודנדריטי ב-ACC. האוריינטציות של תאי הדנדריט והסומה אושרו באמצעות צביעת גולג'י12.

1. מקם את אלקטרודת AgCl (המוגדרת כאנודה) פרוקסימלית ל- ACC ומקם את האלקטרודה השנייה (המוגדרת כקתודה) דיסטלית ל- ACC. רשום את עוצמת השדה הנוצרת על ידי שני כיווני השדה (מקבילים ומאונכים לסיבים האקסודנדריטיים ACC) על ידי MEA, והעבר את זרמי השדות החשמליים באמצעות מגרה.
2. תקן את המרחק של אלקטרודות AgCl (כ 1.5-2 ס"מ), ולהתאים את עוצמת הנוכחי של הממריץ כדי להפוך את DCS בין 0.5 ל 2 mA.

5. תגובות סינפטיות קורטיקליות המושרות חשמלית

הערה: השראת תגובות סינפטיות ב-ACC על ידי גירוי חשמלי ב-MT, שבו מחולל גירוי חשמלי הניתן לתכנות מייצר פולסי זרם דו-פאזי מלבניים.

1. חזור על סעיף 3 לעיל.
2. מניחים אלקטרודת טונגסטן ב- MT, ומעבירים פולסים מהממריץ לאזור התלאמי של הפרוסות באמצעות אלקטרודות טונגסטן דו קוטביות.
3. השתמש בעוצמות זרם שונות כדי לקבוע את הסף שמעורר תגובת ACC. כאן, השתמשו בעוצמה של ±150 μA ומשך של 200 μsec, מה שעורר תגובה מקסימלית של 80% ב-ACC ברוב הפרוסות.
4. הזז את אלקטרודת הטונגסטן לאורך מסלול התלמוסינגולטים (מ- MT ל- corpus callosum) בפרוסה MT-ACC כדי לקבל את פרופילי התגובה האופטימליים.
5. בצע 10-20 טאטוא של תגובות ACC, והשתמש בתוכנה כדי לבצע ממוצע אוטומטי של כל ה- ACC המתעורר על-ידי גירוי MT. התוצאה היא התגובות הסינפטיות ב-ACC המושרות מגירוי MT על ידי מסלול MT-ACC.

6. פעילות דמוית התקף המושרה חשמלית

הערה: פעילות דמוית התקף נגרמה על ידי יישום של 4-aminopyridine (4-AP; 250 μM) ו bicuculline (5 μM). מחקרי בקרת זמן קודמים הראו כי תגובות מקסימליות ויציבות הופיעו 2-3 שעות לאחר השימוש בתרופה14.

1. חזור על סעיף 5 לעיל.
2. הוסף תרופות לתמיסת הזילוח. יש להשתמש ב-4-AP (4-Aminopyridine) (250 מיקרומטר) וב-bicuculline (5 מיקרומטר). מערבבים את התרופות באופן אחיד וממשיכים בזילוח במשך 2-3 שעות.
3. כדי להקל על פעילות דמוית התקף, שמרו על משאבת הזילוח בקצב זילוח מהיר יחסית (8 מ"ל/דקה), מה שיכול גם לסייע במניעת הצטברות שיפוע pH.
4. מקם אלקטרודת טונגסטן ב- MT, וספק גירוי חשמלי (150 μA, משך 200 מיקרו-שניות) כדי לקבל פרופילי תגובת ACC.
5. בצע 10-20 טאטוא וממוצע התגובות.
6. החלף את תמיסת הזילוח ב- aCSF טרי כדי לשטוף את התרופות. חזור על שלב 6.5.

תוצאות

איור 1: הכנת פרוסת Thalamocingulate והגדרת מערכת הקלטה MEA. (A) הליך פרוסת MT-ACC (א) הסר את המוח ו-(ב) העבר ל-aCSF מחומצן קר. (ג) בצע שני חתכים פאראסגיטליים מקו האמצע. (ד) מבט מהצד על החלק המדיאלי של גוש המוח. (ה) לבצע שני חתכים גחונים זוויתיים של גוש המוח. (ו) הדביקו את גוש המוח על צלחת פלסטיק זוויתית. (ז) בצעו חתך גבי ופתחו את גוש המוח. (ח) הדביקו את גוש המוח בוויברטום. (i) אספו פרוסות מגוש המוח. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איזופלורן	תאגיד מוצרי Halocarbon	NDC 12164-002-25	4%
aCSF (סה"כ:1 L):
D(+)-גלוקוז	מרק	1.08337.1000	10 מ"מ
נתרן מימן פחמתי	מרק	1.06329.0500	25 מ"מ
נתרן כלורי	מרק	1.06404.1000	124 מ"מ
(+)-נתרן L-אסקורבט, >=98%	סיגמא	A4034-100G	0.15 גרם/2 צלזיוס
מגנזיום גופרתי, נטול מים, ReagentPlus	סיגמא	M7506-500G	2 מ"מ
סידן כלורי דיהידראט	מרק	1.02382.1000	2 מ"מ
נתרן דימימן פוספט מונוהידראט	מרק	1.06346.1000	1 מ"מ
אשלגן כלורי	מאי & בייקר בע"מ דאגנהאם, אנגליה	MS 7616	4.4 מ"מ
(+)-Bicuculline	טוקריס	130	5 מיקרומטר ב- aCSF
4-אמינופירידין	טוקריס	940	250 מיקרומטר ב-aCSF
ויברטומה	ויברטומה	סדרה 1000	חוסמים את החיתוך לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר
בדיקות מערך מרובה אלקטרודות (MEA): 6 x 10 מישורי MEA	מערכות רב ערוציות	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	קוטר אלקטרודה, 30 מיקרומטר; מרווח בין אלקטרודות, 500 מיקרומטר; עכבה, 50 kΩ ב-200 הרץ
בדיקות מערך מרובה אלקטרודות (MEA): 8 x 8 MEA	איינדה ביוסיסטמס	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	אלקטרודה בצורת פירמידה; קוטר, 40 מיקרומטר; גובה קצה, 50 מיקרומטר; מרווח בין אלקטרודות, 200 מיקרומטר; עכבה, 1,000 kΩ ב-200 הרץ
שימוש במגבר של 60 ערוצים עם מסנן פס שהוגדר בין 0.1 הרץ ל-3 קילוהרץ בהגברה של 1,200X	מערכות רב ערוציות	MEA-1060-BC
תוכנת MC Rack בקצב דגימה של 10 KHz	מערכות רב ערוציות		תוכנה לאיסוף נתונים והקלטות
שליטה על מחולל דופק	מערכות רב ערוציות	STG 1002
פרוסות ערכות עיגון והחזקות	וורנר אינסטרומנטס	שד-26ח/10; WI64-0250
משאבה פריסטלטית מיניפולסים3	גילסום	MINIPULS3	קצב זילוח : 8 מ"ל/דקה
ממריץ מבודד	מערכות A-M	דגם 2100	עוצמה של ±350 μA , משך של 200 μsec
אלקטרודת טונגסטן	מערכות A-M	575300	ממוקם בתלמוס

נעשה