כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. תרופות עבור Microiontophoresis
הערה: התרופות המשמשות למיקרויונטופורזיס חייבות להיות בעלות מטען חשמלי כאשר הן מומסות במים. בדוק את הספרות כדי לראות אם התרופה של עניין מתאים להליך זה. כאן מתואר הנוהל של gabazine, אנטגוניסט של קולטן GABAA.
- סנן מים מזוקקים באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותם ולוודא שהם אינם מכילים מומסים. באמצעות מים מזוקקים אלה, להכין ~ 1,000 μl של 20 mM gabazine.
- כוונן את ה- pH של הדילול ל- 4 עם NaOH מסונן של 0.2 מיקרומטר באמצעות אלקטרודת pH עדינה.
- לאחסן 100 - 200 μl aliquots ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר ביום ההקלטה. באותו יום, לפני שהחיה מרוסנת, מלא את החביות (3 - 5 מיקרוליטר) של האלקטרודה הרב-חבית בתרופות, באמצעות מיקרומזרק 100 μl המצויד במחט פלסטיק גמישה.
2. ניתוח והשתלת עמוד ראש
- בצע ניסויים בשני עכברים זכרים מסוג CBA/J (Mus musculus) במשקל של 27 ו-30 גרם.
- בימים שלפני הניתוח, טפלו בבעלי החיים ואפשרו להם לחקור בחופשיות בחדר ההקלטה כדי להרגיל אותם אליו. בצעו שלושה אימונים ביום, שכל אחד מהם נמשך לפחות 30 דקות. זה ירגיע אותם ויגרום להם להרגיש בנוח במהלך ההקלטות.
- מרדימים את העכבר באמצעות תערובת של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) המוזרק תוך שרירית. מינון זה מרדים מאוד את החיה במשך כשעה. יש לתת מנות משלימות של שליש מהמנה הראשונית לפי הצורך.
- הניחו את בעל החיים על שמיכת חימום כדי לשמור על טמפרטורה של 38 ± 1 מעלות צלזיוס וייצבו את ראש החיה במסגרת סטריאוטקסית באמצעות שני מוטות אוזניים ומוט נשיכה. היזהר לא לנקב את הקרום הטימפאני עם מוטות האוזן.
- הגן על העיניים על ידי החלת טיפה של ג'ל עיניים.
- לגלח את הקרקפת באמצעות מספריים ולמרוח פובידון-יוד כדי לחטא את העור.
- באמצעות אזמל, לבצע חתך לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת ולמשוך את periosteum המכסה את החלק הקודקוד ואת החלק rostral יותר של עצמות העורף.
- הדביקו עמוד ראש קל משקל של duralumin (משקל ~0.65 גרם, אורך 30 מ"מ, איור 1A) עם בסיס עגול ושטוח (קוטר 5 מ"מ) על הגולגולת. הדביקו חוט כסף לאמצע עמוד הראש והותירו את קצותיו חופשיים. חוט הכסף ישמש כאלקטרודת הייחוס לרישום האלקטרופיזיולוגי.
- יש למרוח שכבה דקה של דבק הניתן לריפוי קל על הגולגולת ועל בסיס עמוד הראש. המתינו 10 שניות והניחו את עמוד הראש מעל האזור הרוסטרלי של עצמות הקודקוד, לאורך קו האמצע.
- אור לרפא את הדבק באמצעות מקור אור כחול למשך 20 שניות לקבלת חוזק מליטה יעיל.
- קדח שלושה חורים סביב ומאחורי בסיס עמוד הראש באמצעות מקדחה חשמלית ומקדח קטן.
- הניחו שני ברגי שעון (~ 2 מ"מ אורך) בחורים שנקדחו כדי שישמשו כנקודות מגע נוספות בין הגולגולת לבמת הראש. הברגים דורשים 1/21 סיבובים כדי להשיג התאמה צמודה. בדוק את הברגים עם מלקחיים כדי לוודא שהם לא רופפים.
- הכנס את קצה חוט הארקה הכסוף לחור השלישי, וודא שהוא בא במגע עם הדורה. יש למרוח טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט עמיד במים כדי לקשור את החוט לגולגולת.
- החל מרוכב מרפא אור כדי לחזק את הקשר של עמוד הראש עם הגולגולת. כסו את בסיס עמוד הראש, את החלק הנמוך של חוט הכסף ואת הברגים, תוך זהירות שלא להאריך מאחורי למבדה כדי לאפשר גישה במהלך ההקלטה. לרפא באמצעות מקור אור כחול.
- משכו את השריר בחלק האחורי של הצוואר בסמוך להכנסתו לגולגולת. בעזרת טרפין קטן (קוטר 2.35 מ"מ), קודחים חלון עגול ממש מתחת לתפר הלמדא ולרוחב לקו האמצע, כדי לחשוף את הקוליקולוס התחתון (IC). משכו את עצם הכיסוי בפינצטה עדינה כאשר הגבולות רופפים. אם מתרחש דימום, יש לשטוף במי מלח קרים וסטריליים כדי לעצור אותו.
- השתמש מרוכב כדי ליצור קיר קטן (~ 1 מ"מ רוחב ~ 1 מ"מ גובה) סביב החלון ולרפא אותו אור.
- מכסים את הגולגולת והשריר החשופים במשחה אנטיביוטית. לאחר מכן, להרטיב את פני השטח החשופים של IC עם מלוחים סטריליים ולכסות אותו עם ג'לי נפט, מילוי היטב שנוצר לאחר ביצוע הקיר סביב חלון ההקלטה.
- להזריק buprenorphine תת עורית (0.03 מ"ג / ק"ג, מדולל 1: 10 במי מלח סטריליים) כמו משכך כאבים.
- השאירו את בעל החיים על שמיכת החימום עד שהוא מתעורר והחזירו אותו לכלוב הדיור שלו כדי להתאושש מהניתוח במשך שלושה ימים לפני ההקלטה. החזיקו חיות בכלוב הדיור של חולדות בודדות כדי למנוע מחבריהן לכלוב לנקות את הג'לי ואת עמוד הראש שנגע במכסה רשת המתכת. הניחו מעט העשרה בכלוב כאשר בעל החיים נמצא בבית יחיד. כמו כן, לשנות את הנסורת מדי יום כדי למנוע זיהום בזהירות לבדוק כי החיה מתאוששת כראוי ולא מראה סימנים של אי נוחות. כמו כן, בדוק אם ג'ל פטרולאום נמצא מעל חלון ההקלטה ומגן על המוח החשוף.
3. הקלטה אלקטרופיזיולוגית ומיקרויונטופורזיס
- לאחר ההתאוששות, תנו לבעל החיים זמן להתאקלם בסביבת ההקלטה ולרסן את ראשו. התאקלמו את החיה על-ידי קיבוע עמוד הראש למחזיק בזמן שהעכבר יושב על משענת קצף מרופדת בהתאמה אישית המגולפת לגודל גופו (איור 1B). זה יגביל את תנועות העכבר ויתרום לשלוותו.
- התחל עם 10 דקות הפעלות בהדרגה להגדיל את משך עד 120 דקות. במהלך הפגישה, תגמלו את בעלי החיים בנוזלים מתוקים (חלב מרוכז, מדולל 30:70 במים) בפרקי זמן נתונים. מאוחר יותר, במהלך סשן ההקלטה, תן את אותו תגמול בתחילת הפגישה ובסופה, או בזמן שאף נוירון אינו מבודד.
- אם בעל החיים מתרגש לפני ההקלטה, הזריקו את תרופת ההרגעה הקלה אצפרומזין (2 מ"ג/ק"ג, תוך צפקית). על פי המערכת העצבית של עניין, הרגעה יכול להשפיע על התוצאות שלך.
- תן לחיה לחקור בחופשיות את תא ההקלטה במשך 5 - 10 דקות.
- הניחו את גוף החיה בתוך משענת קצף מרופדת בהתאמה אישית (איור 1B).
- הצמידו את עמוד הראש למחזיק המחובר למסגרת הסטריאוטקטית (איור 1C). זהו זמן טוב לתת לחיה פרס נוזלי.
- כסו את גוף בעל החיים בשמיכת כותנה והדקו אותו באופן רופף באמצעות חצי גליל פלסטיק וסרט הדבקה.
- הסר את ג'ל הפטרולאום מחלון ההקלטה ושטוף במי מלח סטריליים חמים.
- תיעוד פעילות עצבית ויישום יונטופורטי של gabazine.
- הניחו את האלקטרודה הרב-חבית על מחזיקה, נשלטת על ידי מיקרו-כונן ומחוברת למיקרומניפולטור.
- חבר את החוטים להקלטה באמצעות קליפסים קטנים של תנין. חבר את הטרמינל החיובי לקצה אלקטרודת הטונגסטן, ואת מסוף הקרקע לחוט הכסף שבא במגע עם הדורה.
- הניחו חוט כסף לא מצופה בתוך כל חבית כך שקצה אחד יתחבר לתמיסה והשני יהיה נגיש. חבר קצוות אלה להתקן המיקרויונטופורזיס, בהתאם להוראות היצרן.
- הזיזו את האלקטרודה הרב-קנית עד שהקצה יבוא במגע עם פני השטח של המוח. החל מלוחים סטריליים חמים כדי למנוע את התייבשות של רקמת המוח. בשלב זה, להחיל זרם שימור (-10 nA עבור gabazine; לבדוק את הספרות עבור התרופה המסוימת) כדי למנוע דליפה של התרופה מקצה החבית בעת חיפוש פעילות יחידה אחת.
- השתמש בטכניקות סטנדרטיות לבידוד פעילות חוץ-תאית של נוירון יחיד. קבל את אזור תגובת התדר (FRA) של תא העצב, כלומר שילוב של תדרים ועוצמות המסוגלים לעורר תגובה מכיוון שתא העצב רגיש לצלילים אלה.
- בחר שני תדרים (f1 ו- f2) המעוררים קצב ירי ותבנית דומים. הציגו כל אחד מהתדרים הללו כגירוי נדיר שחוזר על עצמו תחת פרדיגמת ה-oddball.
הערה: בקצרה, בפרדיגמת האי-זוגיות, תדר אחד (f1) מוצג כגירוי חוזר עם הסתברות גבוהה להתרחשות, ואילו השני (f2) הוא הגירוי הסוטה המתרחש לעתים רחוקות, המשולב באופן אקראי בין החוזרים על עצמם. ברצף אי-זוגי שני, ההסתברויות היחסיות של שני הגירויים הפוכות.
- שחרר את gabazine על ידי העברת הנוכחי לערכים חיוביים (10 - 20 nA). השג שוב את ה- FRA וחזור על פרדיגמת ה- oddball תחת יישום gabazine. שמור על הפליטה עד שנצפתה השפעה נראית לעין בקצב הירי; זה בדרך כלל לוקח 5 - 20 דקות, בהתאם לתרופה מסוימת, הריכוז שלה, ואת גודל זרם הפליטה. חזור על פרוטוקול ההקלטה כדי לקבל את הערכים תחת השפעת התרופה.
- עצור את ההזרקה על-ידי החזרת הזרם לערכי שמירה. המתן עד שהשפעת התרופה תישטף על ידי מעקב אם ה- FRA או התגובה לפרדיגמת ה- oddball חוזרת לשלוט בערכים.
הערה: מפגשי ההקלטה יכולים להימשך 2 - 3 שעות ביום ויש לסיים מוקדם יותר אם בעל החיים מראה סימן כלשהו של אי נוחות או מאבק. תן תגמול נוזלי וכסה את תא ההקלטה בג'לי נפט.
