$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תרבית משותפת של אסטרוציטים MN וחוט השדרה בלוחות מערך מרובי אלקטרודות
- להבדיל ולצלחת את הנוירונים המוטוריים והאסטרוציטים כאשר הם מוכנים לשימוש באותו יום ומיושנים עד היום במבחנה (DIV) 60 עבור הנוירונים המוטוריים ו- DIV 90 עבור האסטרוציטים.
- צפו את צלחות MEA ביום שלפני או ביום הציפוי כדלקמן אם עובדים עם לוחות פלסטיק 24 בארות (Table of Materials).
- לדלל פוליאורניתין (PLO) במים או במי מלח חוצצי פוספט (PBS) עד 100 מיקרוגרם/מ"ל.
- מוסיפים 15-20 μL לכל באר (תלוי ברמת הנוחות של פיפטה), ויוצרים טיפה במרכז הבאר המכסה את שטח האלקטרודות והסביבה אך לא את כל הבאר.
- היזהר לא לפגוע אלקטרודות עם קצה פיפטה. היו עקביים עם נפח מבאר לבאר כדי להבטיח כיסוי של אותו שטח פנים בכל באר.
- לדגור אש"ף ב 37 ° C במשך מינימום של 1 שעה (רצוי 2 שעות).
הערה: הנפחים הקטנים יתייבשו אם אין מספיק לחות בצלחות. הוסיפו מים לתאים המקיפים בארות כדי להבטיח לחות מספקת במהלך הציפוי וההקלטות.
- שאפו כמה שיותר אש"ף באמצעות קצה מיקרופיפטה מפלסטיק. יש להקפיד לא לגעת באלקטרודות. יש לשטוף עם 250 מיקרוליטר מים שלוש פעמים. אם אתם משתמשים בשואב ואקום לשטיפות, אין לאפשר את הקצה ליד מערך האלקטרודות. לאחר השטיפה השלישית, להסיר כמה שיותר מים, באמצעות קצה פיפטה לפי הצורך. הניחו למשטח להתייבש מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים עם הסרת המכסה.
- לאחר שמשטחי הצלחת יבשים, הוסיפו למינין מדולל ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS. השתמש ב- 15-20 μL כדי לכסות כל מערך אלקטרודות. הוסיפו מים לתאי הלחות, החליפו את המכסה והחזירו את הצלחת לדגירת 37°C למשך שעתיים לפחות עד לילה.
- ביום הציפוי, שטפו את תרביות הנוירון המוטורי (MN) והאסטרוציטים פעם אחת עם PBS והוסיפו טריפסין 0.05% ב-37°C כדי להרים תאים (5 דקות). יש לאסוף לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מעכב טריפסין ולשטוף צלחות עם מדיום או בסיס כדי להבטיח שכל התאים נאספים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו resuspend עם פיפטה 1000 μL כדי לייצר 1 מ"ל של תא בודד השעיה. בעת השעיה מחדש של MN ואסטרוציטים, עברו למדיום התרבית המשותפת (טבלה 1), עם תוספת של 20 מיקרומטר מעכב סליל סליל הקשור ל-Rho היוצר חלבון סרין/תראונין קינאז (ROCK-I).
- לספור את MN ואת האסטרוציטים במקביל באמצעות hemocytometer. בזמן ספירה וחישובים, סגרו את מתלי התאים והניחו אותם במדף קלקר בטמפרטורה של 4°C.
- חשב את הנפח הדרוש כדי להשעות מחדש את התרביות לריכוז של 5 x 104 תאים לכל 5 μL עבור נוירונים מוטוריים ו 2.5 x 104 תאים לכל 5 μL עבור אסטרוציטים. צנטריפוגה את מתלי התא 1 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשהיה מחדש בנפח מחושב.
- חשב את מספר הבארות הרצוי להיות זרע ולהכפיל אותו ב 5 μL של כל השעיה התא. ערבבו את הנפח הנדרש של מתלי נוירונים ואסטרוציטים ביחס של 1:1 וערבבו על ידי פיפטינג עד לשילוב יסודי (בדרך כלל פעמיים) אך הימנעו מלהיות אגרסיביים מדי.
- מוציאים את הלמינין מכל באר של צלחת MEA באמצעות קצה פיפטה. מעבירים 10 μL של תרחיף התא המשולב הסופי לכל באר, ויוצרים טיפה קטנה המכסה את מערך האלקטרודות כדי לספק צפיפות תאים של 5 x 104 MN ו- 2.5 x 104 אסטרוציטים לכל באר.
הערה: צפיפות תאים גבוהה בתרחיף המשולב דורשת השעיה תכופה בין בארות במהלך שלב הזריעה כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת ועקבית.
- מחזירים את הצלחות לאינקובטור למשך 20-30 דקות. היזהר לא להפריע טיפת התא ולאפשר לתאים ליצור קבצים מצורפים ראשוניים על הלוחות.
- לאחר 20-30 דקות, הוסף מדיה חמה לתרבות משותפת + ROCK-I לכל באר על ידי פיפט 250 μL למטה על הקיר של כל באר, ולאחר מכן 250 μL נוספים במורד הקיר של אותה באר בצד הנגדי. מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
- בחנו את הצלחות יום לאחר הזריעה (יום התרבות המשותפת 1). אם יש פסולת תאים משמעותית או תאים מתים, החליפו את התווך במדיום תרבית משותפת טרי המכיל ROCK-I. אחרת, שנו את המדיום ביום השני לאחר הזריעה (יום התרבות המשותפת 2) למדיום התרבות המשותפת ללא ROCK-I. בצעו החלפות חצי בינוניות (שאפו 50% והוסיפו 60% מהנפח הסופי כדי להתחשב באידוי) פעמיים בשבוע.
- אם משתמשים במערכות MEA עם לוחות זכוכית 30 מ"מ באר אחת (טבלה של חומרים), הכנת הצלחת עשויה להימשך יומיים או יותר. בצע את השלבים הבאים כדי לבצע זאת.
- הרימו את התאים ואת פסולת התאים מתרביות MEA קודמות עם 0.05% טריפסין למשך 5-15 דקות.
- שאפו טריפסין ושטפו שלוש פעמים במים.
- יש לעקר על ידי הוספת אתנול 70% ולדגור במכסה המנוע למשך 10 דקות. לשאוף את האתנול ולאחר מכן לשטוף במים שלוש פעמים.
- יש למרוח במים חומר ניקוי 1% אניוני עם אנזים פרוטאז. מכסים את הצלחות במכסה ועוטפים בסרט תרמופלסטי וברדיד אלומיניום, ואז משאירים אותם על נדנדה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- שאפו את חומר הניקוי, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים במים.
- אם מתכננים לאחסן את הצלחות, להוסיף נפח מספיק של מים. מכסים את הצלחות במכסה ועוטפים אותן בסרט תרמופלסטי ובנייר אלומיניום ומשאירים אותן במקרר עד לשימוש הבא.
- אם אתם מתכננים לצפות, תנו למשטח להתייבש מתחת למכסה המנוע של תרבית התא.
- אם יש צורך בעיקור נוסף (למשל, זיהום קודם או שימוש לא לאחרונה), בשלב זה בלבד, יש לחשוף את לוחות MEA לאור אולטרה סגול (UV) מתחת למכסה המנוע למשך 30-60 דקות.
הערה: הימנעות מאור UV תכוף תמנע נזק לאלקטרודות. השימוש באור UV כאשר על צלחות יש סרום יגרום לאלקטרודות לא פונקציונליות, ולכן יש להשתמש בו רק על צלחות ניקוי.
- כאשר הצלחות יבשות לחלוטין, המשיכו בניקוי פלזמה למשך דקה אחת כדי לטעון את משטח הזכוכית של לוחות MEA ולשפר את יעילות הציפוי. ניקוי פלזמה לפחות פעם ב-4-5 מחזורים של מחזורי ציפוי ציפוי צלחות MEA.
- כחלופה, כאשר ניקוי פלזמה אינו אפשרי או לא מוצדק, יש להוסיף נפח מספיק של מדיום המכיל סרום בקר עוברי (FBS) כדי לכסות את פני השטח של לוחות MEA ולהחזירם לאינקובטור למשך הלילה.
- יש להשתמש בציפוי PLO (פוליאורניתין)/למינין. יש להוסיף תמיסת אש"ף (100 מיקרוגרם ב-PBS) מיד לאחר ניקוי פלזמה או שאיפה ושטיפה של המדיום המכיל FBS.
- צלחת את התאים כנ"ל בצפיפויות הבאות: 1 x 105 אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) / צלחת ו- 5 x 105 נוירונים מוטוריים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-MN)/צלחת.
2. הקלטת מערך מרובה אלקטרודות
- חלץ את נתוני המתח הגולמי בתדר דגימה של 12.5 קילוהרץ, באמצעות מסנן Butterworth עם מעבר גבוה של 200 הרץ ומסנן מעבר נמוך של 3 קילוהרץ. הגדר זיהוי ספייק כנקודות זמן מיידיות של מתחים ≥6 סטיות תקן מקו הבסיס. זהה התפרצויות כפעילות עם קפיצות של >5 ב-100 אלפיות השנייה. הגדר את פעילות הרשת כאשר יותר מ- 35% מכלל האלקטרודות הפעילות יורות בטווח של 100 אלפיות השנייה, עם מינימום של 50 קפיצות בכל פרץ רשת.
- התחל להקליט בהקדם האפשרי לאחר יום Co-Culture (CC) 1.
הערה: פעילות חשמלית תצוין לעיתים רחוקות לפני יום CC 3.
- לוחות מקבילים בצפיפות דומה ומשכפלים בלוחות התרבית המתאימים או בכיסויים לבדיקות ביוכימיות, אימונוציטוכימיה (ICC) או PCR כמותי (qPCR).
- בצע הקלטות כאשר הטמפרטורה מוגדרת ל- 37 ° C ו- CO2 ב- 5%. העבירו את הצלחות למכונה ואפשרו להן להתאזן לפחות 5 דקות לפני ההקלטה.
- הקלט פעילות בסיסית אחת ליומיים או מדי שבוע, במשך 1-15 דקות, בהתאם לתכנון הניסוי. אל תקליט לפחות שעה אחת לאחר חילופי דברים בינוניים, ורצוי להמתין 24 שעות לאחר כל חילופי מדיה.
- כדי למנוע זיהום, שנה את התווך (כלומר, חצי חילוף בינוני כמו בשלב 1.14) לאחר כל הקלטה שבה יש לפתוח את מכסה הצלחת הסטרילית מחוץ למכסה המנוע הסטרילי (כלומר, יישום של תרכובות סמים). בצע החלפות בינוניות מלאות ושטיפות כדי לשטוף את התרופות אם צלחות הולכים להמשיך לשמש מעבר לטיפול תרופתי.
- למטרות ניתוח, השתמש לפחות בשלושה עותקים טכניים וביולוגיים עבור כל מצב. לבטא נתונים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות n ≥ 3 משוכפלים.