מדידה סימולטנית של פוטנציאל הסידן והקרום התוך-תאי באנדותל מוחי של עכבר

תקציר

מקור: Hakim, M. A. et al. מדידות סימולטניות של סידן תוך-תאי ופוטנציאל קרום באנדותל מוחי של עכבר מבודד ושלם. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון מדגים מדידה סימולטנית של רמות סידן תוך-תאיות ושינויים בפוטנציאל הממברנה בתאי אנדותל של מקטעי עורק מוח עכברי. צינורית האנדותל המבודדת עמוסה במחוון סידן פלואורסצנטי ומטופלת בתרופה הגורמת לשחרור סידן תוך תאי, וכתוצאה מכך לשינוי בפוטנציאל הממברנה. הפלואורסצנטיות של המחוון מאפשרת מדידה של רמות הסידן, ואלקטרודת הקלטה מוחדרת לתא כדי למדוד שינויים בפוטנציאל הממברנה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. דיסקציה ובידוד של עורק המוח

הערה: כל הליכי הדיסקציה דורשים הגדלת דגימה (עד פי 50) באמצעות סטריאומיקרוסקופים והארה המסופקים על ידי מקורות אור סיבים אופטיים. כדי לבצע הליכי דיסקציה לבידוד המוח והעורקים, השתמש במכשירי דיסקציה מושחזים. כלי מיקרודיסקציה לבידוד וניקוי עורקים כוללים מלקחיים מושחזים בעלי קצוות עדינים ומספריים לדיסקציה בסגנון Vannas (להבים של 3 עד 9.5 מ"מ).

1. בידוד מוח עכבר
   1. יש להרדים עכבר C57BL/6 (בן 3-30 חודשים; זכר או נקבה) באמצעות שאיפת איזופלורן (3% למשך 2-3 דקות), ולאחר מכן לערוף את ראשו של בעל החיים מיד לאחר השראת הרדמה מלאה. מניחים את הראש בכלי פטרי (קוטר 10 ס"מ, עומק 1.5 ס"מ) המכיל תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) קרה (4°C) אפס Ca²⁺ תחת סטריאומיקרוסקופ.
   2. צפייה דרך המיקרוסקופ, להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת ולהסיר דם עודף עם אפס קר Ca^{2 +} PSS. בצע חתך רק באמצעות קצות מספריים סטנדרטיים לדיסקציה (למשל, להב 24 מ"מ), החל מהעצם העורפית ועד עצם האף של הגולגולת.
   3. פתח את הגולגולת בזהירות לאורך החתך באמצעות מלקחיים גסים, והפרד רקמת חיבור כדי לבודד את המוח עם מעגל שלם של Willis.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במלקחיים חותכי עצם Littauer כדי לפתוח את הגולגולת ולחשוף את המוח.
   4. שטפו בעדינות את המוח המבודד עם אפס קר Ca²⁺ PSS בכוס כדי להסיר דם. הניחו את הצד הגחוני של המוח כשהוא פונה כלפי מעלה בתא המכיל תמיסת דיסקציה קרה לבידוד עורקי המוח (איור 1A).
2. בידוד עורקי המוח
   הערה: עורק המוח האחורי נבחר כמודל מחקר אנדותל מוחי מייצג עבור פרוטוקול זה.
   1. אבטחו את המוח המבודד בתמיסת דיסקציה קרה באמצעות פיני נירוסטה (קוטר 0.2 מ"מ, אורך ~ 11–12 מ"מ) שיוכנסו לפולימר סיליקון מועשר בפחם המצפה את התחתית (עומק ≥50 ס"מ) של צלחת פטרי זכוכית.
   2. כדי לשמור על טמפרטורה צוננת של PSS במהלך הדיסקציה, יש להשתמש בתא דיסקציה מקורר על ידי מערכת קירור המרכיבה ברציפות תערובת מים-אתילן גליקול ביחס של 1:1. לחלופין, ניתן לבצע דיסקציה על קרח טרי.
   3. בודדו בניתוח את עורקי המוח האחוריים (~ 0.3 עד 0.5 ס"מ מקטעים, ללא מתח צירי) מהעורקים המתקשרים האחוריים והבזילריים באמצעות מכשירי מיקרודיסקציה, מספריים בסגנון Vannas ומלקחיים מחודדים בעלי קצוות עדינים (איור 1B). השתמשו בסיכות נירוסטה (קוטר 0.1 מ"מ, אורך ~13–14 מ"מ) כדי לאבטח את שני עורקי המוח האחוריים המבודדים בתמיסת הדיסקציה בצלחת הפטרי (איור 1C).
   4. נקו את עורקי המוח האחוריים המבודדים בזהירות על-ידי הסרת רקמת חיבור באמצעות מלקחיים מחודדים (איור 1D). חתכו עורקים שלמים למקטעים (אורך 1–2 מ"מ) לעיכול אנזימטי (איור 1D; כניסה).

2. הכנת צינור אנדותל ועירוי

1. הכינו את מנגנון הטריטורציה באמצעות מיקרוסקופ המצויד במטרות (10x, 20x ו-40x), מצלמה ובמת אלומיניום המחזיקה תא ומיקרומניפולטורים. אבטחו מיקרומזרק באמצעות בקר משאבה צמוד לבמה ולדגימה (איור 2A).
2. ממלאים לחלוטין פיפטה טריטורציה בשמן מינרלי ומאבטחים אותה מעל בוכנה מיקרו-מזרק. לאחר מכן, באמצעות מזרק מיקרו עם בקר משאבה, למשוך פתרון דיסוציאציה לתוך פיפטה (~ 130 nl) על גבי שמן מינרלי תוך הבטחת היעדר בועות אוויר פיפטה.
3. מקמו מקטעי עורקים שלמים לתוך 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה בצינור זכוכית של 10 מ"ל (איור 2B), המכיל 0.31 מ"ג/מ"ל פפאין, 0.5 מ"ג/מ"ל דיתיואריתריטול, 0.75 מ"ג/מ"ל קולגנאז ו-0.13 מ"ג/מ"ל אלסטאז. יש לדגור בטמפרטורה של 34°C למשך 10-12 דקות לעיכול חלקי.
4. לאחר העיכול, החלף את תמיסת האנזים ב~5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה טרייה. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מעבירים קטע אחד לתוך תא המכיל את תמיסת הדיסוציאציה בטמפרטורת החדר (RT).
5. מניחים את פיפטה לתוך תמיסת הדיסוציאציה בתא וממקמים אותה קרוב לקצה אחד של הכלי המעוכל. קבעו קצב בטווח של 2 עד 5 nL/s בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה (איור 2C; כניסה).
6. תוך כדי צפייה דרך הגדלה של פי 100 עד פי 200, משכו והוציאו את מקטע העורקים כדי לנתק תאי שריר חלקים תוך יצירת צינור אנדותל. במידת הצורך, השתמש בזהירות במלקחיים עדינים כדי להפריד adventitia מנותקת ולמינה אלסטית פנימית מצינור האנדותל. אשרו שכל תאי השריר החלק מנותקים ושרק תאי אנדותל נשארים כ"צינור" שלם (איור 2C).
7. באמצעות מיקרומניפולטורים, אבטחו כל קצה של צינור האנדותל על חלקת כיסוי הזכוכית של תא האיחוי באמצעות פיפטות הצמדת זכוכית בורוסיליקט (איור 2D).
8. לשטוף החוצה adventitia מנותק ותאי שריר חלק מן החדר ולהחליף את פתרון דיסוציאציה עם 2 mM CaCl₂ PSS. העבר את הפלטפורמה הניידת עם צינור אנדותל מאובטח למיקרוסקופ של עירוי ומתקן ניסיוני.
9. השתמשו ב-6 מאגרים נקיים של 50 מ"ל (איור 3A) לאספקה רציפה של PSS ותמיסות תרופתיות מתאימות במהלך הניסוי, לפי הצורך. השתמש בשסתום בקרת הזרימה המוטבע כדי להגדיר ידנית את קצב הזרימה לכל אורכו בהתאם לזרימה למינרית תוך התאמת הזנת הזרימה לשאיבת ואקום. העבירו PSS לתא (איור 3B) עבור עירוי של צינור האנדותל במשך 5 דקות ≥ לפני הקלטת נתוני הרקע וטעינת הצבע.

3. הגדרות עומס צבע, שטיפה וטמפרטורה

1. הפעל את כל רכיבי מערכת הפוטומטריה למדידה [Ca²⁺]_i. השתמשו במיקרוסקופ שעל מתקן הניסוי (איור 3C) כדי לראות את צינור האנדותל בהגדלה של פי 400, והתמקדו בתאים בחלון הפוטומטרי באמצעות חבילת התוכנה של מערכת הפוטומטריה.
2. מדוד את קוטר צינור האנדותל ורשום ערכי אוטופלואורסצנטיות ברקע בהתאם לפליטה של 510 ננומטר במהלך עירור לסירוגין ב- 340 ו- 380 ננומטר (≥10 הרץ).
3. כדי למדוד תגובות תוך-תאיות של Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i), טען את צינור האנדותל בצבע Fura-2 AM (אסטר Fura-2-אצטוקסימתיל, ריכוז סופי של 10 מיקרומטר) ב-RT ואפשר ~30-40 דקות בהיעדר אור.
4. הפעל מחדש עירוי של צינור האנדותל עם PSS טרי למשך ~30-40 דקות כדי לשטוף את עודפי הצבע ולאפשר ל- Fura-2 AM תוך תאי לנטרל אסטריפיקציה. במהלך תקופת השטיפה, העלו את הטמפרטורה בהדרגה מ-RT ל-37°C באמצעות בקר הטמפרטורה (איור 3A) עם תנור חימום מוטבע, ולאחר מכן שמרו על טמפרטורה של 37°C לאורך כל הניסוי.
   הערה: המעבר המצטבר המומלץ בין RT ל- 37 ° C כרוך בשלושה שלבים (למשל, 5 ° C) עם זמן שיווי משקל של ≥5 דקות בכל שלב.

4. מדידה סימולטנית של [Ca²⁺]_i ו- V_m

1. הפעל את כל הציוד האחר ואת חבילת תוכנות האלקטרומטר למדידת פוטנציאל הממברנה (V_m, ראה איור 3, איור 4). התאם את קצב איסוף הנתונים בהתאם (≥10 הרץ).
2. משוך אלקטרודה חדה ומלא בחזרה עם 2 M KCl. למחקרים על צימוד בין-תאי באמצעות העברת צבע, מלאו את המיקרואלקטרודות ב-0.1% פרופידיום יודיד מומס ב-2 M KCl.
3. אבטחו את האלקטרודה על חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה המחובר לשלב ראש אלקטרומטר המאובטח באמצעות מיקרומניפולטור. השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם לזמן קצר את קצה האלקטרודה לתוך PSS זורם בתא תוך צפייה דרך המטרה 4x.
4. הגדר את ה- V_m במנוחה ל- 0 בהתאם לפוטנציאל האמבטיה המוארקת. מקם את קצה האלקטרודה מעט מעל תא של צינור האנדותל. אם תרצה, השתמש בצגי בסיס קוליים המקושרים לאלקטרומטרים כדי לשייך את גובה הצליל להקלטות פוטנציאליות.
5. הגדל את ההגדלה ל- 400x באמצעות המטרה 40x ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך. התאם את החלון הפוטומטרי באמצעות תוכנת הפוטומטריה כדי להתמקד ב~50 עד 80 תאי אנדותל.
6. הכניסו בעדינות את האלקטרודה לאחד התאים של צינור האנדותל באמצעות המיקרומניפולטור והמתן ≥2 דקות עד שה-V_m במנוחה יתייצב. באופן דומה, הכנס אלקטרודה שנייה לתא אחר (מרחק ≥100 מיקרומטר) מהתא הראשון המשופד עם אלקטרודה ראשונה.
7. ברגע ש-V_m במנוחה יציב בערכיו הצפויים (-30 עד -40 mV), הפעל את ה-PMT בממשק הפלואורסצנטי בהיעדר אור והתחל לרכוש תוך תאי [Ca²⁺]_i על ידי הפעלת Fura-2 לסירוגין (10 הרץ) ב-340 ו-380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלואורסצנטיות ב-510 ננומטר.
   הערה: כדי לבדוק צימוד חשמלי בין-תאי, זרם (± 0.5-3 nA, ~ 20 s משך פעימה) יכול להיות מועבר באמצעות אלקטרומטר אחד כמו "אתר 1", ושינויים של V_m ניתן לרשום עם אלקטרומטר אחר כמו "אתר 2" (מרחק ≥100 מיקרומטר).
8. לאחר שנקבעו מדידות סימולטניות של V_m ו- [Ca²⁺]_i, אפשר ~ 5 דקות לעירוי של צינור אנדותל עם PSS בקצב זרימה למינרי קבוע לפני יישום תרופות.
9. יש למרוח את התרופה (למשל, אדנוזין טריפוספט [ATP]) שהוכנה ב-PSS על תא העירוי עם קצב זרימה קבוע. לאחר ~3 דקות (או פרק זמן המתאים לקינטיקה של התרופה), שטפו עם PSS עד ש-V_m ויחס F₃₄₀/F₃₈₀ יחזרו לתנאי הבסיס שלהם. סמן הקלטות מתאימות כסונכרנות באופן זמני בין חבילות התוכנה של הפוטומטר והאלקטרומטר במהלך כל מעבר של פתרונות.
10. לאחר סיום הניסוי, משוך אלקטרודה מהתא באמצעות המיקרומניפולטור ושים לב V_m ~ 0 mV כפי שמתייחס אלקטרודת האמבטיה. הפסק הקלטות מתאימות של V_m ו- [Ca²⁺]_i ושמור את הרשומות בקובץ לצורך ניתוח נתונים.

תוצאות

איור 1: בידוד של עורק המוח מהמוח. (A) מוח מבודד עם עורקים שלמים (חץ לבן מציין את עורק המוח האחורי) בתמיסת דיסקציה. (B) תצוגה מוגדלת של עורק המוח האחורי (חץ לבן; ~3x לעומתלוח א'). (C) עורקי מוח אחוריים מבודדים המאובטחים בסיכות נירוסטה בצלחת הדגימה. (D) עורקי המוח האחוריים לאחר הסרת רקמות חיבור. הכניסה מראה קטעים חתוכים של עור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)	G7021
NaCl	סיגמא	S7653
MgCl2	סיגמא	M2670
CaCl2	סיגמא	223506
HEPES	סיגמא	H4034
KCl	סיגמא	עמ' 9541
נאוה	סיגמא	S8045
ATP	סיגמא	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)	A466250
Collagenase (תערובת סוג H)	סיגמא	C8051
דיתיואריתריטול	סיגמא	D8255
פפאין	סיגמא	עמ' 4762
אלסטאז	סיגמא	E7885
BSA	סיגמא	A7906
פרופידיום יודיד	סיגמא	עמ' 4170
DMSO	סיגמא	D8418
צבע Fura-2 AM	Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב (ארצות הברית)	F14185
צ'ילר מסתובב (Isotemp 500LCU)	תרמופישר סיינטיפיק	13874647
תא עירוי פרספקס	וורנר אינסטרומנטס, קמדן, קונטיקט, ארה"ב (ארצות הברית)	RC-27
כיסוי זכוכית תחתון (2.4 × 5.0 ס"מ)	תרמופישר סיינטיפיק	12-548-5 מ'
פלטפורמת אלומיניום אנודיזציה (קוטר: 7.8 ס"מ)	וורנר אינסטרומנטס	PM6 או PH6
שלב אלומיניום קומפקטי	Siskiyou, Grants Pass, OR, ארה"ב (ארצות הברית)	8090P
מיקרומניפולטור	סיסקיו	MX10
סטריאומיקרוסקופים	Zeiss, NY, ארה"ב (ארצות הברית)	Stemi 2000 ו-2000-C
מקורות אור סיבים אופטיים	שוט, מיינץ, גרמניה &�200, צרפת	Fostec 8375
מיקרוסקופ הפוך של Nikon	Nikon Instruments Inc, מלוויל, ניו יורק, ארה"ב (ארצות הברית)	צ2
מטרות ניגודיות פאזות	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X ו-20X)
יעדים פלואורסצנטיים	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) ו-40X (Plan Fluor)
מיקרוסקופ הפוך של Nikon	Nikon Instruments Inc	ליקוי חמה TS100
בקר משאבת מיקרומזרק (Micro4)	World Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	SYS-MICRO4
טבלת בידוד רעידות	ייצור טכני, פיבודי, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	מיקרו-גרם
מגברים	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	Axoclamp 2B &; Axoclamp 900A
כותרות ראשיות	התקנים מולקולריים	HS-2A ו-HS-9A
מחולל פונקציות	EZ Digital, סיאול, קוריאה הדרומית	FG-8002
מערכת איסוף נתונים	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	Digidata 1550A
צגים בסיסיים נשמעים	Ampol US LLC, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	BM-A-TM
אוסצילוסקופ אחסון דיגיטלי	Tektronix, Beaverton, Oregon, ארה"ב	TDS 2024B
ממשק מערכת פלואורסצנטית, מנורת ARC + ספק כוח, Hyperswitch, PMT	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	מערכות IonOptix
בקר טמפרטורה	וורנר אינסטרומנטס	TC-344B או C
תנור חימום מוטבע	וורנר אינסטרומנטס	ש- 27ב
בקר שסתום	וורנר אינסטרומנטס	VC-6
שסתום בקרת זרימה מוטבע	וורנר אינסטרומנטס	FR-50
מושך אלקטרוני	סאטר אינסטרומנטס, נובאטו, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	P-97 או P-1000
מיקרופורג'	Narishige, East Meadow, NY, ארה"ב (ארצות הברית)	MF-900
צינורות זכוכית בורוסיליקט (טריטורציה)	World Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	1B100-4
צינורות זכוכית בורוסיליקט (סיכה)	וורנר אינסטרומנטס	G150T-6
צינורות זכוכית בורוסיליקט (אלקטרודות חדות)	וורנר אינסטרומנטס	GC100F-10
מסנן מזרקים (0.22 מיקרומטר)	תרמופישר סיינטיפיק	722-2520
צלחת פטרי זכוכית + סילגארד פחם	מכשור מערכות חיות, סנט אלבנס סיטי, VT, ארה"ב (ארצות הברית)	DD-90-S-BLK
מספריים בסגנון Vannas (3 מ"מ ו-9.5 מ"מ)	מכשירים מדויקים בעולם	555640S, 14364
מספריים להבים 3 ו-7 מ"מ	Fine Science Tools (או FST), פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב	מוריה MC52 &; 15000-00
מלקחיים מושחזים בעלי קצוות עדינים	FST	דומונט #5 ודומונט #55