מאמר שיטה

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

DOI:

10.3791/3125

⸱

13 בנובמבר 2011

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל ביטוי RNA של אזורי מוח עכברים נפרדים דורש אסטרטגיית איסוף רקמות מדויקת וניתנת לחזרה. פרוטוקול המשתמש הן בחתך מוח קורונלי והן במיקרו-דיסקציה בעזרת רקמות מתואר כאן. התשואה והאיכות של סך ה-RNA המתקבלים מהדגימות המתקבלות מאשרים את התועלת של השיטה המתוארת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפלטפורמות טכנולוגיות, לגישות כמו ריצוף מהדור הבא, מיקרו-מערך ו-qRT-PCR יש הבטחה גדולה להרחבת ההבנה שלנו לגבי רוחב הרגולציה המולקולרית. גישות חדשות יותר כגון ריצוף RNA ברזולוציה גבוהה (RNA-Seq)1 מספקות מידע חדש ומרחיב על ביטוי ספציפי לרקמה או למצב כגון רמות תעתיק יחסיות, שחבור חלופי ומיקרו RNAs2-4. הסיכויים לשימוש בשיטת RNA-Seq בפרופיל טרנסקריפטום שלם השוואתי5 בתוך רקמות נפרדות או בין קבוצות נפרדות פנוטיפיות של אנשים מספקים דרכים חדשות להבהרת מנגנונים מולקולריים המעורבים במצבים פיזיולוגיים נורמליים וחריגים כאחד. לאחרונה בוצע פרופיל טרנסקריפטום שלם על רקמת מוח אנושית, וזיהה הבדלים בביטוי גנים הקשורים להתקדמות המחלה6. עם זאת, השימוש בריצוף מהדור הבא עדיין לא שולב באופן נרחב יותר במחקרי יונקים.

מחקרי ביטוי גנים במודלים של עכברים דיווחו על פרופילים שונים בתוך גרעיני מוח שונים באמצעות מיקרוסקופ לכידת לייזר (LCM) לכריתת דגימה7,8. בעוד ש-LCM מאפשר איסוף דגימות עם דיוק של תא בודד ואזור מוח בדיד, תפוקת ה-RNA הכוללת הנמוכה יחסית מגישת LCM יכולה להיות מונעת ל-RNA-Seq וגישות פרופיל אחרות ברקמות מוח של עכברים ועשויות לדרוש שלבי הגברת דגימה לא אופטימליים. כאן, מוצג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה ומיצוי RNA כולל מאזורי מוח נפרדים של עכברים. קורות רקמות בקוטר מוגדר משמשות לבידוד 13 רקמות ממקטעים עטרתיים סדרתיים של 750 מיקרומטר של מוח עכבר בודד. דגימות מיקרופונץ' רקמות מוקפאות מיד ומאוחסנות בארכיון. סך ה-RNA מתקבל מהדגימות באמצעות טכנולוגיית בידוד RNA כולל המופעלת על ידי חרוזים מגנטיים. לדגימות RNA המתקבלות יש תפוקה ואיכות נאותות לשימוש בפרופיל ביטוי במורד הזרם. אסטרטגיית מיקרו-דיסקציה זו מספקת אפשרות בת קיימא לאסטרטגיות איסוף דגימות קיימות להשגת RNA כולל מאזורי מוח בדידים, ופותחת אפשרויות לגילויים חדשים של ביטוי גנים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הגדרת דגימה והכנתה

  1. הוסיפו את תמיסת המלח המאוזנת (EBSS) של ארל עם נתרן ביקרבונט (0.44 גרם ל-100 מ"ל EBSS) וגלוקוז (0.884 גרם ל-100 מ"ל EBSS)9. טפל ב-EBSS עם DEPC (0.1 מ"ל לכל 100 מ"ל EBSS) למשך 12 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס בבקבוק או בקבוק לחיטוי עם חלק עליון של בורג.
  2. מניחים 5 פיפטות פסטר מזכוכית בגודל 3/4 אינץ' לתוך זכוכית של 1000 מ"ל, ומניחים את מברשות האמן, כשהזיפים פונים כלפי מעלה, לתוך גליל בעל סירוגי זכוכית של 100 מ"ל. הוסף תמיסת DEPC מספקת (0.1 מ"ל לכל 100 מ"ל ddH2O) כדי לכסות את הפיפטות והמברשות, בהתאמה. מכסים את הכוס ואת הגליל המדורג בנייר אלומיניום, ודוגרים לפחות 12 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר דגירה של 12 שעות עם DEPC, מחממים את כל החומרים שטופלו ב-DEPC לטמפרטורה >100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. הסר את EBSS וקרר לטמפרטורת החדר לפני האחסון ב-4 מעלות צלזיוס. יוצקים ddH2O מהכוס ומהגליל המדורג; המשיכו לדגור בטמפרטורה של >100 מעלות צלזיוס עד שהחומרים יבשים. מוציאים, מצננים לטמפרטורת החדר ושומרים לשימוש מאוחר יותר.
  4. ביום הניסוי, טפל בכל משטחי העבודה עם RNaseZap.
  5. יש להניח ולשמור על EBSS באמבט מים המוגדר ל-40 מעלות צלזיוס. כדי לחצץ ולחמצן את ה-EBSS, הסתנן עם 95%/5% O2/CO2 על ידי הכנסת צינורות גז לתוך פיפט פסטר נטול RNase והכנסת הפיפט לתוך ה-EBSS. יש לכסות את פתח מיכל ה-EBSS.
  6. הגדר פורס רקמות Stoelting לשימוש בחתך סדרתי של רקמת המוח. טפל במשטחים העליונים והתחתונים של פורס הרקמות באמצעות RNaseZap. חבר חתיכה מלבנית של נייר סינון Whatman #4 למשטח זכוכית פרספקס של קוצץ הטישו. חבר סכין גילוח כפול קצה לזרוע המסוק. הגדר את המיקרומטר לאפס, והתאם את הגובה המינימלי של זרוע המסוק כדי לאפשר לסכין הגילוח לחתוך את נייר המסנן, אך לא את לוחית זכוכית הפרספקס.
  7. אסוף את כל החומרים הנוספים הדרושים למיקרו-דיסקציה, כולל צלחות תרבית תאים 60x15 מ"מ ללא RNase, ליבות רקמות Harris Uni-Core, 200 מיקרוליטר קצות מיקרופיפטה ללא RNase להדבקה על צינורות גז לחמצון EBSS של חלקי מוח קורונליים במהלך ניקוב מיקרו-דגימה, מספריים מעוקלים, קרח יבש וצינורות לאיסוף רקמות. הניחו צינורות על קרח יבש.

2. הסרת מוח וחתך עטרה

  1. הכניסו את העכבר לתוך DecapiCone וערפו את ראשו באמצעות גיליוטינה של מכרסמים. מוציאים את הראש מה-DecapiCone ומניחים על משטח ישר. בעזרת אזמל, חותכים את העור לאורך קו האמצע של הגולגולת החל מ-3 מ"מ זנב עד הנחיר. קלף לרוחב את דשי העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת וארובות העיניים.
  2. בעזרת מספריים מעוקלים חותכים את שני עצבי הראייה ומנתקים את הקשר שלהם לעין. פתח את חלל הגולגולת על ידי שבירה בזהירות של העצמות העורפיות והבין-קודקודיות והסרת העצמות הגביות, הקודקודיות והקדמיות. בעזרת עצמות שוברים את עצמות האף והדמעות כדי לחשוף את נורות הריח. השתמש במספריים מעוקלים כדי לחתוך את נורות הריח הרחק מהמוח הרוסטרלי. הסר את כל המוח עם המוח האחורי שלם. הניחו את המוח בחלק העליון של צלחת תרבית תאים של Cellstar בגודל 60 x 15 מ"מ ללא RNase. מעבירים למשטח העבודה של דגימת הרקמות.
  3. השתמש בפיפט נטול RNase כדי להרטיב באופן שמרני את נייר הסינון לקוצץ הטישו המצורף עם EBSS. הרטיבו את רקמת המוח עם EBSS.
  4. העבירו את המוח למסוק הרקמות והגדירו כיוון מתאים. הערה: יש למקם את המוח כשמשטח הגחון מונח על נייר המסנן. קו האמצע (סדק בין-המיספרה) צריך להיות מאונך ללהב המסוק, והקצה הרוסטרלי של המוח צריך להיות צמוד ללהב.
  5. השתמש במברשת אמן שטופלה ב-DEPC כדי להחזיק את המוח נייח על ידי הפעלת לחץ עדין על פני השטח הגביים של המוח. תוך כדי החזקת המוח נייח, הרם את ידית מחזיק הלהב למעלה כ-4-5 ס"מ מעל פני הרקמה הגבית והחזק אותה במצב זה. הסירו את המברשת מפני השטח של המוח, וחייגו 750 מיקרומטר באמצעות המיקרומטר. אפשר למנוף ליפול, קוצץ את הרקמה ויוצר חתך קורונלי של 750 מיקרומטר.
  6. בזמן שלהב המסוק נשאר נייח, השתמש בתנועת גלגול עם מברשת האמן כדי להחליק בעדינות את חלק הרקמה הרחק משטח הלהב. הנח מיד את קטע הרקמה לתוך ה-EBSS המחומצן בצלחת הפטרי. חוקר שני יכול להתחיל בשלב 3.1.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו-2.6 עד שהתקבלו קטעי מוח סדרתיים על פני כל המישור הרוסטרו-זנבי.

3. מיקרו-דיסקציה של אזור המוח

  1. התאם את התאורה כדי להבטיח שתאורת הדגימה לא תיחסם במהלך מיקרו-דיסקציה של רקמות. התאם את המיקום והזרימה של תערובת של 95%/5% של O2/CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצנת ומחומצנת לרקמה במהלך מיקרו-דיסקציה.
  2. זהה את קטע המוח העטרתי הכולל את אזור העניין. כוונו את אזור המוח שטוח בתחתית צלחת הפטרי בעזרת מברשת אמן. בחר את קורר הרקמות בקוטר מתאים על סמך טבלה 1 או הפניות אחרות. תוך כדי החזקת קטע רקמת העטרה במקומו עם מברשת האמן, הורד את קצה החיתוך של קורר הרקמות כלפי מטה על פני קטע הרקמה.
  3. תוך כדי הפעלת לחץ, לחץ על קצה קורר הרקמות דרך חלק הרקמה ומטה בחוזקה על תחתית צלחת הפטרי. השתמש בתנועה מעגלית מתגלגלת כדי להבטיח שאזור העניין נותק מהרקמה שמסביב. הרם בזהירות את קורר הרקמות הרחק מקטע הרקמה ושחרר את המיקרו-אגרוף, מה שמאפשר לו לצוף ב-EBSS.
  4. בעזרת מברשת אמן, הפקידו מיד את המיקרופונץ' לתוך צינור אחסון יציב בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס הנשמר על קרח יבש. הרקמה צריכה להיצמד בקלות לצד הצינור. החזר את הצינור המכיל מיקרו-דגימה לקרח היבש.
  5. חזור על שלבים 3.2 - 3.4 עבור כל אזור מוח מעניין.

4. ארכיון רקמות

  1. לאחר השלמת המיקרו-דיסקציה, השתמש במערכת הסורק VisionMate כדי להקליט את הברקודים המתאימים עבור כל צינור TrakMates המכיל דגימה. לאחר מילוי מתלה הצינור TrakMates בעל 96 חריצים, סרוק במהירות את המתלה והנח מיד את דגימות הרקמה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA.

5. מיצוי RNA כולל

  1. הכן סביבת עבודה נטולת RNase באמצעות RNaseZap. הכן כמות מספקת של תערובת חרוזים מגנטית ותמיסת ליזה/כריכה כמתואר בפרוטוקול בידוד RNA כולל MagMAX-9610.
  2. הסר דגימות רקמה מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והנח את הצינורות ישירות על קרח יבש.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הליזיס/קשירה לצינור TrakMates המכיל דגימה. חבר עלי נטול נוקלאז בגודל צינור 0.5 מ"ל למיקסר הגלולה והומוגניזציה של הרקמה. בעזרת קצה פיפט נטול נוקלאז בעל שימור נמוך, העבירו את הדגימה ההומוגנית לבאר על צלחת תרבית רקמות עם תחתית עגולה של 96 בארות. הוסף מיד 60 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול לדגימה באמצעות קצה פיפט נטול נוקלאז בעל שימור נמוך, וערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
  4. הוסף 20 מיקרוליטר מתערובת החרוזים לדגימה באמצעות קצה פיפט נטול נוקלאז עם שמירה נמוכה. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
  5. חזור על שלבים 5.3-5.4 עבור כל דגימות הרקמה.
  6. בצע את השלבים של פרוטוקול בידוד RNA כולל MagMAX-96 החל מ-III.A.2 כדי להשלים את מיצוי ה-RNA הכולל. הערה: ערכות בידוד RNA כוללות אחרות התומכות בחרוזים מגנטיים זמינות מסחרית; עם זאת, הם לא נבדקו במחקר זה. אנא עיין במדריכי ערכת היצרן לפרטים על בידוד RNA כולל באמצעות המוצרים המתאימים.
  7. מדוד את הטוהר והריכוז של ה-RNA הכולל המתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop 3300 או טכנולוגיות ספקטרופוטומטר/פלואורומטר אחרות בנפח קטן.

6. תוצאות מייצגות:

<גבול טבלה="1"> אזור המוח/גרעין קוטר קורר רקמות (מ"מ) סה"כ RNA (ננוגרם/מיקרוליטר) יחס של 260/280 קליפת המוח הקדמית 2.0 27.03 1.99 גרעין אקומבנס 1.0 6.26 2.77 סטריאטום 1.5 27.94 2.19 קליפת המוח החגורה 1.5 29.05 2.07 היפותלמוס - גרעין פרה-חדרי / גרעין סופרכיאזמטי (PVN/SCN) 2.0 40.34 2.03 תלמוס 2.0 34.40 2.00 היפותלמוס - גרעין דורסומדיאלי / גרעין גחוני (DMH/VMH) 2.0 44.83 2.05 אמיגדלה 1.0 10.06 1.89 היפוקמפוס - Ca 2/3 1.5 7.31 2.32 היפוקמפוס - Ca1/Dentate Gyrus 1.5 5.20 2.24 אפור פריאקודוקטי 1.0 48.21 2.02 גרעין רפה גבי 1.0 6.56 2.18 היווצרות רשתית 2.0 35.35 2.27

טבלה 1. ספירה של אזורי מוח של עכברים מנותחים במיקרו עם קוטר קורר רקמות אופטימלי בהתאמה, מייצג את תפוקת ה-RNA הכוללת והטוהר. 13 אזורי המוח המנותחים, המפורטים בסדר רוסטרו-זנב, משתנים בגודלם ובכיוונם. המיקרו-פונץ' PVN/SCN כולל את הגרעין הפרה-חדרי האנטרומדיאלי, חלקים מהגרעין הפרי-חדרי, האזור התת-חדרי ונוירונים פרוו-תאיים אחרים. המיקרו-אגרוף של התלמוס כולל גרעיני תלמוס קדמיים הממוקמים באותו מישור עטרתי כמו אזור המיקרו-אגרוף PVN/SCN. המיקרו-אגרוף DMH/VMH כולל גרעינים מגנו-תאיים אביזרים ונוירונים פרוו-תאיים אחרים הממוקמים בין הגרעין הגבי לגרעין הגחון. דגימת האמיגדלה כוללת גם את תת-האזורים המרכזיים וגם את הבסיסיים. תפוקת ה-RNA ויחס 260/280 הם ערכים בודדים המתקבלים מדגימות מיקרו-דיסקציה מתאימות כדי להדגים קריאות המתקבלות מכל אזור במוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם שלבים קריטיים רבים בפרוטוקול זה המצדיקים תשומת לב ושיקול דעת קפדניים. יש לקבוע את בחירת קוטר קורר הרקמות המתאים להסרת כל אזור עניין בהתאמה. בעוד שקוטרי קורר הרקמות המוצגים בטבלה 1 מתאימים לאיסוף אזורי המוח הרשומים, כל חוקר צריך לקבוע את קורר הרקמות בגודל המתאים לאיסוף אופטימלי של הרקמות המעניינות אותו. שנית, עובי חתך העטרה המדווח בשיטה זו (750 מיקרומטר) נקבע בניסוי כאופטימלי לזיהוי אזורי המוח המעניינים (טבלה 1) בעכברים בוגרים מרקע גנטי שונה. ציוני דרך נוירו-אנטומיים משמשים לאישור הגבולות של אזור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה (DARPA) ומשרד המחקר הצבאי (ARO), מספר פרס W911NF-10-1-006.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמבט מים Isotemp 102Fisher Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
מסובב מעבדה (שייקר מסלולי)Thermo Fisher Scientific, Inc.2314 & #8211;- 1CEQ
מערבל גלולותVWR בינלאומי47747-370
RNase נטול 0.5 מ"ל עליVWR בינלאומיKT749521-0590
דיאתיל פירוקרבונט ללא נוקלאז (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
סכיני גילוח דו-צדדייםStoelting Co.51427
St– פורס רקמות עם מיקרומטר ידניStoelting Co.51425
2/0 אמן עגול s מברשתפרינסטון ארט מברשת4350R
האריס קורר רקמות חד ליבה (0.75 מ"מ)טד פלה, בע"מ15072
Harris Uni-Core Tissue Corer (1.0 מ"מ)TedPella, Inc.15099
Harris Uni-Core רקמות קורר (1.5 מ"מ)טדפלה, בע"מ15075
Harris Uni-Core Tissue Corer (2.0 מ"מ)TedPella, Inc.15076
גיליוטינהבריינטרי סיינטיפיק, בע"מRG-100
DecapiConesBraintree Scientific, Inc.MDC-200
HyClone Earle' תמיסת מלח מאוזנת (EBSS)תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מSH30029.02
25 מ"ל פיפטיםקורנינג4489
epT.I.P.S. נטול נוקלאז. טיפים לפיפט LoRetention Dualfilter, 20 — 300 μ LEppendorf0030 077.636
TrakMates צינורות עליונים עם כובעיםThermo Fisher Scientific, Inc.3741
קורא ברקוד דו-ממדי אלחוטיVisionMate Thermo Fisher Scientific, Inc.3122MTX
VisionMate SR מתלה יחיד קורא ברקוד דו-ממדיThermo Fisher Scientific, Inc.3115
1-200 μ L קצות פיפטה בהתאמה אוניברסליתCorning4864
כלי תרבית תאים CellstarGreiner Bio-One628160Nuclease
Greiner Bio-One 96 בארות צלחת תרבית רקמות פוליסטירן Cellstar, U-bottomUSA Scientific, Inc.5665-0180Nuclease-free
#4 נייר סינוןWhatman, GE Healthcare1004 150
מילוי פיפטות בטיחות מסוג נורת סיליקוןFisher Scientific13-681-102A
NanoDrop 3300 ספקטרופוטומטרThermo Fisher Scientific, Inc.ND-3300
ללא נוקלאז ללא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
  3. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
  4. Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
  5. Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
  6. Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
  7. Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
  8. Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
  9. Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
  10. Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tissue CorerRNAEBSS

מאמרים קשורים