הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

16K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3125

⸱

13 בנובמבר 2011

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

במאמר זה

סיכום

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

תקציר

כפלטפורמות טכנולוגיות, גישות כגון ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing), מערכי מיקרו (microarray) ו-qRT-PCR מבטיחות פוטנציאל רב להרחבת הבנתנו לגבי היקף הבקרה המולקולרית. גישות חדשות יותר, כגון ריצוף RNA ברזולוציה גבוהה (RNA-Seq)1, מספקות מידע חדש ונרחב על ביטוי ספציפי לרקמה או למצב, כגון רמות תמלילים יחסיות, שחבור חלופי ומיקרו-RNA2-4. הסיכויים לשימוש בשיטת ה-RNA-Seq לאפיון השוואתי של התמלול השלם (whole transcriptome profiling)5 בתוך רקמות נפרדות או בין קבוצות של פרטים המובחנים פנוטיפית, פותחים נתיבים חדשים להבהרה של מנגנונים מולקולריים המעורבים הן במצבים פיזיולוגיים תקינים והן בבלתי תקינים. לאחרונה, בוצע אפיון של התמלול השלם ברקמת מוח אנושית, אשר זיהה הבדלים בביטוי גנים הקשורים להתקדמות מחלה6. עם זאת, השימוש בריצוף מהדור הבא טרם שולב באופן נרחב יותר במחקרי יונקים.

מחקרים של ביטוי גנים במודלים של עכברים דיווחו על פרופילים מובחנים בגרעיני מוח שונים תוך שימוש במיקרוסקופיה של לכידה בלייזר (LCM) לחיתוך דגימות7,8. בעוד ש-LCM מאפשר איסוף דגימות ברמת דיוק של תא בודד ואזורי מוח מובחנים, תפוקת ה-RNA הכוללת הנמוכה יחסית בגישת ה-LCM עלולה להוות מכשול ל-RNA-Seq ולגישויות פרופיל אחרות ברקמות מוח של עכברים, ועשויה להצריך שלבי הגברה של הדגימות שאינם אופטימליים. כאן מוצג פרוטוקול למיקרודיסקציה והפקה של RNA כולל מאזורי מוח מובחנים של עכבר. דוקרנים לרקמה בעלי קוטר קבוע משמשים לבידוד 13 רקמות מחתכים קורונליים סדרתיים בעובי 750-μm של מוח עכבר בודד. דגימות מיקרו-פאנץ' של רקמה מוקפאות באופן מיידי ונשמרות בארכיון. RNA כולל מופק מהדגימות באמצעות טכנולוגיה לבידוד RNA כולל המבוססת על חרוזי מגנט. דגימות ה-RNA המתקבלות הן בעלות תפוקה ואיכות מספיקות לשימוש בבדיקות פרופיל ביטוי המשך. אסטרטגיית מיקרודיסקציה זו מספקת חלופה ישימה לאסטרטגיות איסוף דגימות קיימות להשגת RNA כולל מאזורי מוח מובחנים, ובכך פותחת אפשרויות לגילויים חדשים של ביטוי גנים.

פרוטוקול

1. הגדרה והכנה של הדגימה

  1. הוסיפו לתמיסת המלחים המאוזנת של ארל (EBSS) נתרן ביקרבונט (0.44 g לכל 100 mL EBSS) וגלוקוז (0.884 g לכל 100 mL EBSS)9. טפלו ב-EBSS באמצעות DEPC (0.1 mL לכל 100 mL EBSS) למשך 12 שעות לפחות ב-37 °C בבקבוק או בכלי זכוכית בעל מכסה הברגה שניתן לעקר באוטוקלאב.
  2. הניחו פיפטות פסטור מזכוכית בגודל 5 ¾" בתוך כלי זכוכית (beaker) בנפח 1000 mL, והניחו מכחולי אמנות, כאשר הסיבים פונים כלפי מעלה, בתוך משחור זכוכית בנפח 100 mL. הוסיפו תמיסת DEPC מספקת (0.1 mL לכל 100 mL ddH2O) כדי לכסות את הפיפטות והמכחולים, בהתאמה. כסו את כלי הזכוכית ואת המשחור בנייר אלומיניום, והדגירו למשך 12 שעות לפחות ב-37 °C.
  3. לאחר הדגרה של 12 שעות עם DEPC, חממו את כל החומרים שעובדו ב-DEPC לטמפרטורה של >100 °C למשך 15 דקות לפחות. הוציאו את ה-EBSS וקררו לטמפרטורת החדר לפני אחסון ב-4 °C. שפכו את ה-ddH2O מהכלי ומהמשחור; המשיכו להדגיר ב->100 °C עד שהחומרים יתייבשו. הוציאו, קררו לטמפרטורת החדר ושמרו לשימוש מאוחר יותר.
  4. ביום הניסוי, טפלו בכל משטחי העבודה באמצעות RNaseZap.
  5. הניחו ושמרו את ה-EBSS באמבט מים המכוון ל-40 °C. כדי להבטיח באפרינג וחמצון של ה-EBSS, הזרים גז 95%/5% O2/CO2 על ידי הנחת צינור גז בתוך פיפטת פסטור נקייה מ-RNase והחדרת הפיפטה לתוך ה-EBSS. כסו את פתח המיכל של ה-EBSS.
  6. הכינו סכיבת רקמות (tissue slicer) מסוג Stoelting לשימוש בחיתוך סדרתי של רקמת המוח. טפלו במשטחים העליון והתחתון של סכיבת הרקמות ב-RNaseZap. הצמידו פיסת מלבנית של נייר סינון Whatman #4 למשטח הפלקסיגלאס של סכיבת הרקמות. הצמידו להב תער דו-צדדי לזרוע הסכיבה. אפסו את המיקרומטר, וכווןו את הגובה המינימלי של זרוע הסכיבה כך שלהב התער יחתוך את נייר הסינון, אך לא את לוח הפלקסיגלאס.
  7. אספו את כל החומרים הנוספים הדרושים למיקרו-דיסקציה, כולל צלחות תרבית תאים בנפח 60x15 mm נקיות מ-RNase, מחללי רקמות (tissue corers) מסוג Harris Uni-Core, טיפים של מיקרופיפטה בנפח 200 μL נקיים מ-RNase להצמדה לצינור הגז לצורך חמצון של חתכים קורונליים של המוח במהלך דגימת המיקרו-סמפלים, מספריים קמורים, קרח יבש ומבחנות לאיסוף רקמות. הניחו את המבחנות על קרח יבש.

2. הוצאת המוח וחיתוך קורונלי

  1. הנח את העכבר לתוך DecapiCone ובצע עקירה (decapitation) באמצעות גילוטית למכרסמים. הוצא את הראש מה-DecapiCone והנח אותו על משטח שטוח. בעזרת סקלפל, חתוך את העור לאורך קו האמצע של הגולגולת, החל מכ-3 mm קודאלית לנחיר. קלף את פתחי העור לצדדים כדי לחשוף את הגולגולת ואת מכתשי העין.
  2. בעזרת מספריים מעוקלים, חתוך את שני העצבים האופטיים, ובכך נתק את חיבורם לעין. פתח את חלל הגולגולת על ידי שבירה זהירה של העצמות העורפיות (occipital) והבינ-קודקודיות (interparietal) והסרה של העצמות הקודקודיות (parietal) והמצחיות (frontal) הדורסליות. בעזרת קרונז'ור לעצם (bone rongeur), שבור את העצמות הנחריות והדמעיות כדי לחשוף את הפחיתים הריחניים (olfactory bulbs). השתמש במספריים מעוקלים כדי לחתוך את הפחיתים הריחניים מהמוח הרוסטרלי. הוצא את המוח כולו כאשר המוח האחורי נשאר שלם. הנח את המוח בחלקו העליון של צלחית תרבית תאים מסוג Cellstar, נקייה מ-RNase, בגודל 60 x 15 mm. העבר את הדגימה למשטח העבודה לדגימת רקמות.
  3. השתמש בפיפטה נקייה מ-RNase כדי להרטיב באופן שמרני את נייר המסנן המחובר לקוצץ הרקמות (tissue chopper) בעזרת EBSS. הרטב את רקמת המוח ב-EBSS.
  4. העבר את המוח לקוצץ הרקמות והגדר אוריינטציה מתאימה. הערה: המוח צריך להיות ממוקם כך שהמשטח הוונטרלי ינוח על נייר המסנן. קו האמצע (החריץ הבין-המ hemispheric) צריך להיות מאונך ללהב הקוצץ, והקצה הרוסטרלי של המוח צריך להיות צמוד ללהב.
  5. השתמש במברשת אמנותית שעברה טיפול ב-DEPC כדי להחזיק את המוח במקומו על ידי הפעלת לחץ עדין על המשטח הדורסלי של המוח. תוך כדי החזקת המוח במקומו, הרם את מנוף מחזיק הלהב לגובה של כ-4-5 cm מעל משטח הרקמה הדורסלי והחזק אותו במצב זה. הסר את המברשת ממשטח המוח, וכייל 750 μm באמצעות המיקרומטר. שחרר את המנוף שייפול, ובכך יקצוץ את הרקמה ויצור חיתוך קורונלי בעובי 750 μm.
  6. בעוד להב הקוצץ נשאר סטטי, השתמש בתנועה גולגלית עם מברשת האמנות כדי להזיז בעדינות את חיתוך הרקמה הרחק ממשטח הלהב. העבר מיד את חיתוך הרקמה ל-EBSS מחומצן שבצלחית הפטרי. חוקר שני יכול להתחיל בשלב 3.1.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו-2.6 עד לקבלת חיתוך סדרתי של המוח לכל אורך המישור הרוסטרו-קודאלי.

3. מיקרו-דיסקציה של אזורי מוח

  1. כווננו את התאורה כדי להבטיח שהארת הדגימה לא תיחסם במהלך המיקרו-דיסקציה של הרקמה. כווננו את המיקום ואת הזרימה של תערובת 95%/5% של O2/CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצנת ומבופרת עבור הרקמה במהלך המיקרו-דיסקציה.
  2. זהו את חתך המוח הקורונלי הכולל את אזור העניין. יישרו את חתך המוח על תחתית צלחת הפטרי באמצעות מכחול אמנות. בחרו את דוקר הרקמה (tissue corer) בעל הקוטר המתאים בהתבסס על Table 1 או מקורות אחרים. תוך כדי החזקת חתך הרקמה הקורונלי במקומו עם מכחול האמנות, הורידו את קצה החיתוך של דוקר הרקמה אל מעל פני חתך הרקמה.
  3. תוך הפעלת לחץ, לחצו את קצה דוקר הרקמה דרך חתך הרקמה ומטה בחוזקה אל תחתית צלחת הפטרי. השתמשו בתנועה סיבובית כדי להבטיח שאזור העניין הופרד מהרקמה שמסביבו. הרימו בזהירות את דוקר הרקמה מחתך הרקמה ושחררו את המיקרו-פאנץ' (micropunch), כך שיצוף ב-EBSS.
  4. בעזרת מכחול אמנות, העבירו מיד את מיקרו-פאנץ' הרקמה למבחנה לאחסון היציבה ב-80 °C הנשמרת על קרח יבש. הרקמה אמורה להיצמד בקלות לדופן המבחנה. החזירו את המבחנה המכילה את המיקרו-דגימה לקרח היבש.
  5. חזרו על שלבים 3.2 - 3.4 עבור כל אזור מוח רלוונטי.

4. ארכיבון רקמות

  1. לאחר השלמת המיקרו-דיסקציה, השתמשו במערכת הסריקה VisionMate כדי להקליט את הברקודים המתאימים לכל מבחנה מסוג TrakMates המכילה דגימה. ברגע שמעמד המבחנות של TrakMates בעל 96 התאים התמלא, סרקו במהירות את המעמד והעבירו מיד את דגימות הרקמה למקפיא בטמפרטורה של -80 °C עד לביצוע הפקת ה-RNA.

5. מיצוי RNA כולל

  1. הכינו סבירת עבודה נקייה מ-RNase באמצעות RNaseZap. הכינו כמות מספקת של תערובת חרוזי מגנט (Bead Mix) ותמיסת ליזיס/קישור (Lysis/Binding Solution) כפי שמתואר בפרוטוקול MagMAX-96 Total RNA Isolation10.
  2. הוציאו את דגימות הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 °C והניחו את המבחנות ישירות על קרח יבש.
  3. הוסיפו 100 μL של תמיסת ליזיס/קישור למבחנת TrakMates המכילה דגימה. חברו פסטל בגודל של מבחנה של 0.5 ml, הנקי מנוקלאס, למערבל הפלטיות (pellet mixer) והומוגניזו את הרקמה. באמצעות טיפ פפטה בעל ספיגה נמוכה ונקי מנוקלאס, העבירו את הדגימה ההומוגנית לבאר בלוח תרבית רקמה של 96 באערים בעלי תחתית עגולה. הוסיפו מיד 60 μL של 100% isopropanol לדגימה באמצעות טיפ פפטה בעל ספיגה נמוכה ונקי מנוקלאס, וערבבו על ידי שאיבה ופליטה (pipeting up and down) 3-4 פעמים.
  4. הוסיפו 20 μL של תערובת החרוזים (Bead Mix) לדגימה באמצעות טיפ פפטה בעל ספיגה נמוכה ונקי מנוקלאס. ערבבו על ידי שאיבה ופליטה 3-4 פעמים.
  5. חזרו על שלבים 5.3-5.4 עבור כל דגימות הרקמה.
  6. פעלו לפי שלבי פרוטוקול MagMAX-96 Total RNA Isolation החל משלב III.A.2 להשלמת מיצוי ה-total RNA. הערה: קיימים ערכות מסחריות אחרות לבידוד total RNA המבוססות על חרוזי מגנט; עם זאת, הן לא נבחנו במחקר זה. אנא עיינו במדריכי היצרן של הערכות לפרטי בידוד ה-total RNA באמצעות המוצרים הרלוונטיים.
  7. מדדו את הטוהר והריכוז של ה-total RNA שהתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop 3300 או טכנולוגיות ספקטרופוטומטריה/פלואורומטריה אחרות לנפחים קטנים.

6. תוצאות מייצגות:

אזור במוח/גרעיןקוטר דוגם הרקמה (mm)סך ה-RNA (ng/μL)יחס 260/280
קורטקס פרונטלי2.027.031.99
Nucleus Accumbens1.06.262.77
סטריאטום1.527.942.19
קורטקס צינגולרי1.529.052.07
היפותלמוס - גרעין פראוונטריקולרי / גרעין סופראכיאסמטי (PVN/SCN)2.040.342.03
תלמוס2.034.402.00
היפותלמוס - גרעין דורסומדיאלי / גרעין ונטרומדיאלי (DMH/VMH)2.044.832.05
אמיגדלה1.010.061.89
היפוקמפוס - Ca 2/31.57.312.32
היפוקמפוס - Ca1/Dentate Gyrus1.55.202.24
אזור אפור פרי-אקוודוקטלי1.048.212.02
גרעין דורסל רפה1.06.562.18
תצורה רטיקולרית2.035.352.27

טבלה 1. פירוט של אזורי מוח של עכברים שבוצע להם מיקרו-דיסקציה, עם קטרי מחללי רקמה אופטימליים, תנובת RNA כוללת מייצגת ודרגת טוהר. 13 אזורי המוח שעברו מיקרו-דיסקציה, הרשומים בסדר rostro-caudal, נבדלים בגודלם ובכוונם. דגימת המיקרו-פאנץ' של ה-PVN/SCN כוללת את הגרעין הפרה-ונטריקולרי האנטרו-מדיאלי, חלקים מהגרעין הפרי-ונטריקולרי, את האזור הסוב-פרה-ונטריקולרי ונוירונים פרבו-צלולים אחרים. דגימת המיקרו-פאנץ' של התלמוס כוללת גרעיני תלמוס קדמיים הממוקמים באותו מישור קורונלי כמו אזור דגימת המיקרו-פאנץ' של ה-PVN/SCN. דגימת המיקרו-פאנץ' של ה-DMH/VMH כוללת גרעינים מגנו-צלולים נלווים ונוירונים פרבו-צלולים אחרים הממוקמים בין הגרעין הדורסו-מדיאלי לגרעין הוונטרו-מדיאלי. דגימת האמיגדלה כוללת הן את התת-אזורים המרכזיים והן את הבזולטראליים. תנובת ה-RNA ויחסי 260/280 הם ערכים בודדים שהושגו מדגימות מיקרו-דיסקציה בהתאמה, כדי להדגים את הקריאות שהושגו מכל אזור במוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה קיימים מספר שלבים קריטיים הדורשים תשומת לב ומחשבה מעמיקה. יש לקבוע את קוטר מחלץ הרקמה (tissue corer) המתאים להסרה של כל אזור עניין רלוונטי. בעוד שקוטרי מחלץ הרקמה המוצגים ב-Table 1 מתאימים לאיסוף של אזורי המוח המפורטים, על כל חוקר לקבוע את גודל מחלץ הרקמה המתאים לאיסוף אופטימלי של רקמת העניין הרלוונטית עבורו. שנית, עובי החיתוך הקורונלי המדווח בשיטה זו (750 μm) נקבע באופן ניסיוני כעובי האופטימלי לזיהוי אזורי המוח המבוקשים (Table 1) בעכברים בוגרים בעלי רקעים גנטיים שונים. נקודות ציון נוירו-אנט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוצהרו ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי הסוכנות לפרויקטים של מחקר מתקדם לביטחון (DARPA) ומשרד המחקר של הצבא (ARO), מספר מענק W911NF-10-1-006.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מקלחת מים Isotemp 102Fisher Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
רוטטור למעבדה (מנער אורביטלי)Thermo Fisher Scientific, Inc.2314 –- 1CEQ
מערבל כדורים (Pellet mixer)VWR international47747-370
pestle בנפח 0.5 מ"ל, נקי מ-RNaseVWR internationalKT749521-0590נטול נוקלאזים
דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
להבי תער בעלי שני קצוות חיתוךStoelting Co.51427
St–סורק רקמות קפוא עם מיקרומטר ידניStoelting Co.51425
מכחול עגול דק (2/0) לאמנות’מברשת sמכחול Princeton Art4350R
דוגם רקמה Harris Uni-Core (0.75 מ"מ)Ted Pella, Inc.15072
דוקר רקמות Harris Uni-Core (1.0 מ"מ)Ted Pella, Inc.15099
דוגם רקמות Harris Uni-Core (1.5 מ"מ)Ted Pella, Inc.15075
דוקר רקמות Harris Uni-Core (2.0 מ"מ)Ted Pella, Inc.15076
גיליוטינהBraintree Scientific, Inc.RG-100
DecapiConesBraintree Scientific, Inc.MDC-200
HyClone Earle’תמיסת מלחים מאוזנת (EBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30029.02
פיפטות של 25 מ"לCorning4489נטול נוקלאזים
טיפי פפיט epT.I.P.S. LoRetention עם מסנן כפול, 20 — 300 μLEppendorf0030 077.636
מבחנות עם מכסה הברגה TrakMatesThermo Fisher Scientific, Inc.3741
קורא ברקודים דו-ממדי אלחוטי VisionMateThermo Fisher Scientific, Inc.3122MTX
קורא ברקודים דו-ממדי למסגרת אחת VisionMate SRThermo Fisher Scientific, Inc.3115
1-200 μקצות פיפטה בעלי התאמה אוניברסלית LCorning4864נטול נוקלאזים
צלוחי תרבית תאים CellstarGreiner Bio-One628160נקי מנוקלאזים
צלחת תרבית רקמה Cellstar מפוליסטירן עם 96 בארות וקרקע בצורת U, מבית Greiner Bio-OneUSA Scientific, Inc.5665-0180נקי מנוקלאז
#4 נייר סינוןWhatman, GE Healthcare1004 150
מילוי פפיטות בטיחות מסוג נורית סיליקוןFisher Scientific13-681-102A
ספקטרופוטומטר NanoDrop 3300Thermo Fisher Scientific, Inc.ND-3300

מקורות

  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
  3. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
  4. Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
  5. Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
  6. Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
  7. Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
  8. Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
  9. Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
  10. Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרודיסקציה של אזורי מוחטכניקת דגימה של רקמה (Tissue Corer)סביבה נקייה מ-RNAחתכי רקמה סדרתייםמיצוי באמצעות חרוזי מגנטהכנת EBSS
Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.