הדמיה של איתות סידן המושרה על ידי ניקוטין לאורך אקסונים של ההיפוקמפוס הגחוני בתרביות סינפטיות

תקציר

מקור: Zhong, C., et al., <a href="https://app.jove.com/v/52730"> הדמיה חיה של איתות סידן המושרה על ידי ניקוטין ושחרור מוליכים עצביים לאורך אקסונים של ההיפוקמפוס הגחוני. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים כיצד הפעלה בתיווך ניקוטין של קולטני אצטילכולין ניקוטין בהיפוקמפוס הגחוני של העכבר גורמת לאיתות סידן מתמשך לאורך האקסונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הדמיית סידן

1. יש לשטוף תרביות (5 עד 7 ימים במבחנה) במהירות עם HBS רגיל, ולאחר מכן לטעון תרביות עם מחוון Fluo-4 Ca²⁺ 5 מיקרומטר (AM ester) ו-0.02% פלורוני F-127 ב-HBS (2 מ"ל) למשך 30 דקות ב-37°C ו-5% CO₂.
2. שטפו את תמיסת Fluo-4 עם HBS (3 פעמים / 5 דקות). להחזיר את התרביות לאינקובטור (37 ° C / 5% CO₂) למשך 30 דקות לפחות.
3. לשמור על תרביות (5 - 7 ימים במבחנה) בתא הדמיה ולהרכיב את החדר על דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי. יש לנקב ברציפות (1 מ"ל/דקה) עם קוקטייל HBS ב-RT.
4. אסוף תמונות פלואורסצנטיות Fluo-4 של הקרנות אקסונליות ממיקרו-פרוסות vHipp עם יעד Plan-Apochromat (60X מים עם 1.4 NA, עירור 488 ננומטר, פליטה 530 ננומטר) ומצלמת CCD.
5. אספו תמונות פלואורסצנטיות בסיסיות של Fluo-4 (כל 10 שניות למשך 2 דקות) כאמצעי בקרה קדם-ניקוטין. יש למרוח ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זילוח מהיר (2 מ"ל/דקה) למשך דקה אחת, ולאחר מכן לשטוף את הניקוטין עם קוקטייל HBS. המשך לצלם תמונות בהילוך מהיר לפני, במהלך ואחרי מריחת ניקוטין כל 10 שניות למשך 30 דקות.
6. שמור את כל המסגרות של תמונות פלואורסצנטיות גולמיות מסוג fluo-4 וייצא אותן כסדרה של תמונות TIFF לניתוח נוסף.
7. אסוף את העוצמה המשולבת של פלואורסצנטיות fluo-4 לאורך אקסונים vHipp לפני ואחרי מריחת ניקוטין.
8. נרמל את עוצמת הפלואורסצנטיות המשולבת באמצעות המשוואה הבאה: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, כאשר F₀ היא עוצמת הפלואורסצנטיות המשולבת טרום-ניקוטין המתוקנת ברקע, ו-F היא עוצמת הפלואורסצנטיות המשולבת לאורך אקסוני vHipp בכל נקודת זמן לאחר מריחת ניקוטין. לנתח ולהתוות מנורמל עוצמת פלואורסצנטיות משולבת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קוקטייל HBS להדמיה חיה pH=7.3
NaCl	סיגמא	S9888	135 מ"מ
KCl	סיגמא	עמ' 9333	5 מ"מ
מגנזיום כלורי	סיגמא	M8266	1 מ"מ
סידן כלורי	סיגמא	C1016	2 מ"מ
HEPES	סיגמא	H3375	10 מ"מ
גלוקוז	סיגמא	G0350500	10 מ"מ
טטרודוטוקסין	טוקריס	1078	2 מיקרומטר
ביקוקולין	טוקריס	131	10 מיקרומטר
D-AP-5	טוקריס	105	50 מיקרומטר
CNQX	טוקריס	1045	20 מיקרומטר
LY341495	טוקריס	1209	10 מיקרומטר