חקירת פוטנציאל לוואי ממושך של דה-פולריזציה (PDA) בפוטורצפטורים של דרוזופילה

תקציר

מקור: Gutorov, R., et al. שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בפוטורצפטורים של דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים פרוטוקול ניסיוני לחקר פוטנציאל הלוואי הממושך של דה-פולריזציה (PDA) בדרוזופילה לבנה עיניים. עין הזבוב נחשפת לפעימות אור כחול עזות כדי להמיר את רודופסין הפוטופיגמנט למטרהודופסין, מה שגורם למפל איתות שפותח תעלות יונים חיוביות וגורם לדפולריזציה של הממברנה. מאחר שאור כחול מונע המרה מחדש של מטרורודופסין לרודופסין, זרם מתמשך של יונים חיוביים גורם לדפולריזציה מתמשכת, הידועה בשם פוטנציאל לוואי ממושך של דה-פולריזציה (PDA).

פרוטוקול

1. מדידת פוטנציאל לוואי ממושך של דה-פולריזציה (PDA) באמצעות אלקטרורטינוגרמה

1. תנאי גידול מתאימים להכנת Drosophila melanogaster
   1. גידול D. melanogaster זבובים בבקבוקים המכילים תירס צהוב סטנדרטי המכיל מזון באינקובטור הנשמר בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס ובמחזור חושך/אור של 12 שעות.
   2. שמור את בקבוקי הזבוב בחושך לפחות 24 שעות לפני הניסוי.
2. הגדרה כללית
   1. הכינו פיפטות הקלטה על-ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט מלאים בסיבים בגודל 1 מ"מ x 0.58 מ"מ (O.D x I.D) (איור 1L, O). ההתנגדות של פיפטות צריך להיות 5-10 MΩ; ניתן להשתמש בכל מושך מתאים.
   2. ציפוי שני חוטי כסף עם AgCl₂, הכנסת חוט כסף 0.25 מ"מ לפתרון KCl 3 M המחובר לספק כוח 5 V בהתאמה אישית.
   3. הכניסו כל חוט כסף מצופה למחזיקי האלקטרודות (איור 1N).
   4. מלאו את נימי הזכוכית בתמיסת רינגר מסוננת (ראו טבלה 1) באמצעות מזרק חוד מוארך (איור 1M).
   5. הכנס את אלקטרודת החוט לנימי הזכוכית. ודא כי הפתרון בתוך הנימים הוא במגע עם חוט הכסף.
   6. הכניסו את מחזיקי האלקטרודות (איור 2P, N) לשני המיקרומניפולטורים של האלקטרודות (איור 2G).
3. נוהל הכנת הזבוב להקלטות חשמליות
   הערה: כדי לשמור על הזבוב בתנאים המותאמים לכהה, השתמש רק בתאורת אור אדום עמומה במהלך השלבים הבאים.
   1. הרדימו את הזבובים שבבקבוק עם גז_CO2 באמצעות מערכת השינה של הזבובים (איור 1A, B) ושפכו אותם לתוך מיכל השינה.
   2. בחר זבוב אחד והחזק אותו בזהירות בכנפיו באמצעות טוויטר חד. מכסים את שאר הזבובים בצלחת פטרי.
   3. הניחו את הזבוב על מחזיק הזבוב בכיוון הנכון – בשכיבה על צדו, עם גבו לכיוון היד (איור 1P).
   4. הפעל את ספק הכוח של מגהץ ההלחמה. הגדר את הזרם ל- ~2.25 A. זרם זה אמור לחמם את נימה פלטינה-אירידיום 0.25 מ"מ ל~55-56 מעלות צלזיוס.
   5. הניחו טיפת שעווה עם טמפרטורת התכה נמוכה (~55-56°C) על מגהץ ההלחמה (איור 1F).
   6. בעזרת פינצטה, הרימו את הזבוב מכנפיו וקיבעו את כנפיו למחזיק הזבוב (איור 1I) באמצעות מגהץ ההלחמה.
   7. בעזרת מגהץ ההלחמה, חברו את גב הזבוב למשטח המעמד בעזרת שעווה (איור 1P).
   8. הורידו את קצה מגהץ ההלחמה אל נקודת החיבור של הרגליים והמיסו את השעווה כדי לכסות את כל הרגליים יחד (איור 1P).
   9. הניחו טיפה קטנה של שעווה בין הראש לגב באזור הצוואר (איור 1P).
      הערה: יש לנקוט זהירות מיוחדת כדי למנוע חימום יתר של ראש הזבוב. לוודא שהזבוב קבוע כראוי ואינו מסוגל לזוז במהלך הניסוי; תנועות מינוריות עשויות ליצור חפצים בהקלטות. יש לוודא כי פתחי קנה הנשימה (פתחי נשימה) בבית החזה ובבטן אינם מכוסים בשעווה.
   10. הניחו את מחזיק הזבוב (איור 2Q) בכלוב פאראדיי חשוך על גוש מגנט (איור 2I) וודאו שהזבוב נמצא במרחק ~5 מ"מ מקצה מדריך האור (איור 2L).
   11. הניחו את אלקטרודת ההקלטה (איור 2P) מעל עין הזבוב ואת אלקטרודת הקרקע (איור 2N) מעל גבו העליון של הזבוב באמצעות המיקרומניפולטורים.
   12. הכנס את אלקטרודת הקרקע לחלק האחורי של הזבוב באמצעות מיקרומניפולטורים.
   13. הכנס את אלקטרודת ההקלטה לפריפריה החיצונית של עין הזבוב, רצוי, באמצעות micromanipulators.
       הערה: לאחר החדרת האלקטרודה לעין, תיראה גומה קטנה; משוך את האלקטרודה כלפי מעלה מבלי להסיר אותה מהעין עד לגומה להיעלם. האלקטרודות יכולות גם להיות שקועות בטיפות קטנות של ג'לי אלקטרודות המיושמות בפלג הגוף העליון ובעין.
4. פרוטוקול PDA (פרוטוקול זה יכול להתבצע רק על זבובים לבני-עיניים)
   1. תן פולס אור של 5 שניות בעוצמה מרבית באמצעות מסנן כתום (מסנן 590 שוליים, כדי להמיר פוטופיגמנט מקסימלי למצב R).
   2. החלף את המסנן הכתום במסנן כחול רחב פס (BP450/40 ננומטר) ותן שלוש פעימות אור של 5 שניות בעוצמה מרבית.
      הערה: ניתן גם לתת פולס אור כחול ארוך ורציף בעוצמה מרבית עד שמגיעים לתגובת מתח מצב קבוע.
   3. המתן 60 שניות בחושך, החלף את המסנן הכחול במסנן הכתום הקודם, ותן שתי פעימות אור של 5 שניות במרווחים של 60 שניות.

טבלה 1: הרכב הפתרון של רינגר

הפתרון של רינגר
מגיב	ריכוז (mM)
NaCl	130
KCl	2
MgCl2	5
CaCl2	2
HEPES	10
טיטרציה pH ל-7.15 באמצעות NaOH ו-HCl

תוצאות

איור 1: כלים והתקנים הדרושים לקיבוע זבובים ולהכנת פיפטה להקלטה. (א) מערכת שינה מעופפת; (ב) דוושת מערכת שינה מעופפת; (ג) מקור אור קר; (D) מיקרוסקופ סטריאוסקופי; (ה) מחמם נימה בשעווה; (ו) ברזל הלחמה; (ז) דוושת מחמם נימה בשעווה; (H) פינצטה גסה; (I) מעמד לזבוב מגנטי; (J) שעווה בטמפרטורת התכה נמוכה; (יא) מגבונים עדינים; (L) מושך פיפטה אנכי; (יג) מזרק עם קצה מוארך; (יד) מחזיקי אלקטרודות; (O) נימי זכוכית בו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מזרק מ"ל עם קצה מוארך			איור 1M
1 פינצטה גסה		Dumont #5, סטנדרט	0.1 מ"מ × 0.06 מ"מ, אורך 110 מ"מ, Inox (איור 1H)
2 עדשות קונדנסור
ממיר A/D	מכשיר מולקולרי	דיגידאטה 1200	החלפה אפשרית: כל digidata מהתקנים מולקולריים (למשל 1440A) - איור 2C
מגבר	אלקטרוניקה כמעט מושלמת		החלפה אפשרית: מכשירי Warner - IE251A או IE-210 (מגיע עם במת ראש)- איור 2D
שולחן נגד רעידות	ניופורט	פולקסווגן 3036-OPT-01	איור 7H
נימים	מכשיר הרווארד	נימי זכוכית בורוסיליקט	1 מ"מ × 0.58 מ"מ (איור 1O)
קלמפקס	מכשיר מולקולרי		תוכנה
מיכל CO2
מקור אור קר	שוט	KL1500 LCD	איור 1C
מגבים עדינים	קימטק		מגבוני קימוויפס (איור 1K)
מחזיק אלקטרודה			מתאים ל-O.D. נימי 1 מ"מ (איור 1N, איור 2N ואיור 2P)
כלוב פאראדיי	תוצרת בית		סיכוך רעשים אלקטרומגנטי ווילון קדמי שחור (איור 2K)
מסנן (צבע)	שוט	OG590, מסנן קצה	איור 2S
מסנן (צבע)	שוט	BP450/40 ננומטר	איור 2S
מסנן (צבע)	בלייזרים	550 נאנומטר	איור 2S
מסנן (צבע) למקור אור קר	שוט	RG630	איור 1C
מסנן (חום)	שוט	קג3	איור 1S
מסננים (מסנן דחיסות נייטרלית)	כרומה	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	איור 2S
מערכת מנורת פלאש	האניוול		איור 2U
מערכת שינה זבוב עם מזרק	הזרקה + מאטיק		איור 1A-B
ספק כוח למנורה	PTI	LPS-220	איור 2W
גלאי אור	תוצרת בית		פוטו-טרנזיסטור (איור 2O)
מדריך אור			קוטר 3 מ"מ, אורך 1.3 מ' (איור 2L,M)
מקור אור			מנורת קסנון 75W נטולת אוזון בלחץ גבוה (פועלת על 50 W), החלפה אפשרית: Cairn research- OptoLED (איור 7R)
שעווה נמסה בטמפרטורה נמוכה	תוצרת בית		מורכב מתערובת של שעוות דבורים (Tm≈62°C) ופרפין ב~3:1 כדי להגיע לטמפרטורת התכה של ~55-56°C (איור 6J)
מעמד מגנטי לזבובים	תוצרת בית		איור 1I ואיור 2Q
מערכת קדם-מגבר מיקרואלקטרודה עם במת ראש	אלקטרוניקה כמעט מושלמת		בודק עכבה (איור 2G)
מיקרומניפולטור (גס מכני)	חוות דעת על Tritech Research , נארישיגה	M-2
מיקרומניפולטור (קנס מכני)	ליץ מיקרוסיסטמס	ליץ מיקרומניפולטור מכני	איור 2F
pCLAMP	מכשיר מולקולרי		תוכנה
צלחת פטרי			60 מ " מ
מחולל פולסים	אמפי	מאסטר 8	איור 2A
קרם Redux לאלקטרוקרדיוגרפיה	מעבדות פרקר	קרם אלקטרוליטים Redux
נהג תריס	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 חד-ערוצי חד-ערוצי חד-יציב	איור 2V
מערכת תריסים	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 תריסים חד-יציבים בקוטר 2 מ"מ	איור 2V
חוט כסף	וורנר אינסטרומנטס		קוטר 0.25-1 מ"מ, צריך להיות כלוריד
ברזל הלחמה המורכב מנימה פלטינה-אירידיום			קוטר 0.25 מ"מ (איור 2F)
מיקרוסקופ זום סטריאוסקופי	ניקון	SMZ-2B	איור 1D
מיקרוסקופ זום סטריאוסקופי	פראי	פרא M5	עם הגדרות הגדלה של 6, 12, 25 ו-50 (איור 2E)
מסנני מזרקים	מילקס		מסנן PVDF בגודל 22 מיקרומטר
מושך פיפטה אנכי	סאטר/ נארישיגה	דגם P-97/PP-830	השתמשו במושך אנכי או אופקי, לפי העדפה (איור 1L)
מחמם נימה בשעווה	תוצרת בית		איור 1E-G
מערכת מנורת פלאש קסנון	ד"ר ראפ אופטואלקטרוניקה	JML-C2	איור 2X