Method Article

הדמיה ומיפוי של מסלולים עצביים בפרוסת מוח של אמיגדלה

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Bosch, D., et al. Ex Vivo דיסקציה אופטוגנטית של מעגלי פחד בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים הליך לניתוח קישוריות סינפטית בין קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) לבין נוירוני אמיגדלה באמצעות פרוסות מוח אמיגדלה חריפות מעכברים. תאי העצב קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית בעכברים אלה מבטאים צ'נלרודופסין שהתמזג עם חלבון פלואורסצנטי. הצ'אנלרודופינים מאפשרים זרימת יונים ויצירת פוטנציאל פעולה בנוירונים קליפתיים קדם-מצחית קדם-מצחית האמצעית עם הפעלת האור. כתוצאה מכך, נוירוני קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית משחררים מוליכים עצביים שנקשרים לנוירוני אמיגדלה פוסט-סינפטיים, ומפעילים זרמים פוסט-סינפטיים שנרשמים כדי להמחיש קישוריות mPFC-אמיגדלה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הדמיה וגירוי של סיבים פרסינפטיים

  1. הכינו מיקרוסקופ טלאי להפעלה אופטוגנטית של סיבים ותאים:
    1. מרכז את דיודת פולטת האור המותקנת (LED) בנתיב העברת האור.
    2. מדוד את עוצמת אור ה-LED במישור המוקד האחורי ובפלט של כל מטרה באמצעות מד הספק הבוחר את אורך הגל המתאים של 470 ננומטר.
    3. חשב את עוצמת האור ב- mW/mm2 וצור עקומת כיול (עוצמת LED (%) לעומת תפוקת האור (mW/mm2)) עבור כל מטרה עבור ערכים שנמדדו עבור אורך גל של 470 ננומטר.
  2. שלפו פרוסת אמיגדלה חריפה מתא הממשק והניחו בתא הפרוסה המורכב על המיקרוסקופ הזקוף המצויד במנורת פלורסנט. יש להקפיד למקם את הפרוסה כך שמשטח הפרוסה הפונה כלפי מעלה בתא הממשק פונה גם הוא כלפי מעלה בתא ההקלטה. פרוסה עם נוזל מוחי מלאכותי טרי ומחומצן (ACSF) בקצב של 1 - 2 מ"ל/דקה בטמפרטורה של ~31 מעלות צלזיוס.
  3. התבוננו בסיבים קדם-סינפטיים בפרוסה באמצעות מנורת הפלואורסצנט בשילוב עם ערכות סינון מתאימות לחלבון הפלואורסצנטי הספציפי המתבטא. השתמשו במטרה 5x כדי לקבל סקירה כללית (איור 1E), וביעד של 60x להערכת צפיפות הסיבים באזור היעד.
    הערה: עבור GFP ו-YFP, השתמש בערכת מסננים "ירוקה" (עירור 472/20, Beamsplitter 495, פליטה 490 LP) עבור mCherry השתמש בערכת מסנן "אדום" (עירור 560/40, Beamsplitter 585, פליטה 630/70) כמפורט בטבלת החומרים/ציוד.
  4. פתחו או הגבילו את הצמצם במסלול האור במיקרוסקופ לפי הצורך בניסוי (איור 2D).
  5. כדי להשיג הקלטת תיקון, מלא פיפטת תיקון בתמיסה פנימית והרכיב אותה במחזיק אלקטרודות. הפעילו לחץ חיובי על פיפטת המדבקה והורידו אותה לאט תחילה לתמיסת האמבטיה ולאחר מכן תחת בקרה ויזואלית לתוך הפרוסה באמצעות המיקרומניפולטור.
    1. התקרב לנוירון המעניין עם פיפטת המדבקה מהצד ומלמעלה. שחרר לחץ חיובי כאשר פיפטה נמצאת על פני התא (גומה גלויה על פני התא) וקבל "gigaseal" על ידי הפעלת לחץ שלילי.
    2. יש למרוח יניקה נוספת כדי לקרוע את מדבקת הממברנה כדי לקבל רישום של כל התא. לאחר מכן, לעורר סיבים מסומנים עם LED מחובר באמצעות אורך הגל המתאים להפעלת channelrhodopsin (ChR) (470 ננומטר) תוך רישום תגובות חשמליות מהתא.
    3. עבור גירוי סינפטי להתחיל עם עוצמת LED נמוכה ולהגדיל עד משרעת זרם סינפטי הרצוי הוא הגיע. הפעל את נורית ה-LED על-ידי הגדרת יציאות דיגיטליות בתוכנת איסוף הנתונים כדי לשלוט בתזמון ובאורך הדופק (דוגמאות באיור 3).
      הערה: ניתן להשתמש בתוכנות אחרות ו/או בהתקנים יוצרי TTL כדי להפעיל נורית LED.
  6. יש לחזור על הגירוי עם צמצם פתוח או מוגבל (שלב 1.4) במסלול האור במיקרוסקופ לפי הצורך עבור התא המתועד הבא ו/או בנוכחות תרופות ספציפיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. הזרקות סטריאוטקטיות, הכנת פרוסות מוח חריפות, והדמיה של סיבים פרסינפטיים. (א, ב) הזרקת וירוס סטריאוטקטית. א) תמונה של עכבר מורדם מונח במסגרת סטריאוטקטית עם גולגולת חשופה ופיפטה ההזרקה. כניסה: זום בתמונה של פיפטה בהזרקה מלאה בתמיסת וירוס מעורבבת עם ירוק מהיר. סרגל קנה מידה: 3 מ"מ. (B) סכמטי של גולגולת עכבר עם מיקומים מסומנים של חורי קידוח לאזורי הזרקה שונים. (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוזל מוחי מלאכותי (ACSF)לקומפוזיציה ראו הפניות #16 ו- #23
פתרונות תיקון פנימייםלקומפוזיציה ראו הפניות #16 ו- #23
מגנזיום סולפט הפטהידראטRoth, גרמניהP027.1הכנת תמיסת מלאי 2M במים מטוהרים
סטריאוסקופ, SZX2-RFA16אולימפוס, יפן
מנורת פלורסנט Xcite (XI120Q-1492)Lumen Dynamics Group, קנדה2012-12699
מיקרוסקופ טלאי, BX51WIאולימפוס, יפן
מגבר תיקון Multiclamp 700Bהתקנים מולקולריים, ארה"ב
Digitdata 1440Aהתקנים מולקולריים, ארה"ב
תוכנת PClamp, גרסה 10התקנים מולקולריים, ארה"במשמש לשליטה ברכישת נתונים וגירוי
בקרת טמפרטורה לאמבטיה, TC05Luigs &; Neumann, גרמניה200-100 500 0145
מיקרומניפולטור שלושה צירים מיני 25Luigs &; Neumann, גרמניה210-100 000 0010
בקר Micromanipulator SM7Luigs &; Neumann, גרמניה200-100 900 7311
נימי זכוכית לפיפטות טלאיWorld Precision Instruments, גרמניהGB150F-8P
נייר סינון תאית חנקתית לתא ממשקSatorius Stedim Biotech, גרמניה13006--50----ACN
יחידת LED, CoolLED pECoolLED, בריטניה244-1400CoolLED או USL 70/470 ומתאמים מתאימים הם שתי אפשרויות חלופיות לגירוי LED
CoolLED 100 התאמה כפולהCoolLED, בריטניהpE-מתאם-50E
יחידת לד, USL 70/470ראפ אופטואלקטרוניקהL70-000
מתאם עם שתי יציאותראפ אופטואלקטרוניקהבררו עם החברה
ערכת סינון באדום (עירור)AHF, גרמניהF49-560ניתן לקנות מסננים כסט F46-008
(מפצל קרן)AHF, גרמניהF48-585
(פליטה)AHF, גרמניהF47-630
ערכת סינון ירוקה (עירור)AHF, גרמניהF39-472חלופות: ערכת מסננים F36-149 או F46-002 (עם פליטת פסים)
(מפצל קרן)AHF, גרמניהF43-495W
(פליטה)AHF, גרמניהF76-490
LaserCheck, מד חשמל ידניCoherent, ארצות הברית1098293
תוכנת IgorPro, גרסה 6Wavemetrics, ארצות הבריתלניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים, ניתן להשתמש גם בחבילות תוכנה חלופיות אחרות
חבילה נוירומטית של פקודות מאקרו עבור IgorProhttp://www.neuromatic.thinkrandom.com

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Amygdala Brain SlicemPFC Amygdala ConnectivityChannelrhodopsin ActivationOptogenetic DissectionPatch Clamp RecordingFluorescence MicroscopyLED Light CalibrationPostsynaptic Current AnalysisFear Circuit MappingSynaptic Connectivity Visualization

Related Articles