הקלטה של אלקטרורטינוגרמה ופוטנציאל חזותי מעורר בחולדה

תקציר

מקור: Charng, J. et al. השתלה והקלטה של אלקטרורטינוגרמה אלחוטית ופוטנציאל מעורר חזותי בחולדות מודעות. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים כיצד להקליט אלקטרורטינוגרמה (ERG) ופוטנציאל מעורר חזותי (VEP) בחולדה מודעת. החולדה, עם אלקטרודות שהושתלו בניתוח, עוברת תחילה הסתגלות כהה. לאחר החלת טיפות מרחיבות, החיה מונחת בריסן וממוקמת בקערת גנצפלד. אותות ERG ו- VEP נרשמים לאחר מכן.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת אלקטרודות

הערה: משדר תלת-ערוצי משמש להשתלה כירורגית, המאפשר לבצע הקלטה של 2 אלקטרורטינוגרמה (ERG) ו-1 פוטנציאל חזותי מעורר (VEP) בו זמנית. שלוש האלקטרודות הפעילות ושלוש האלקטרודות הלא פעילות צריכות להיות מעוצבות מראש לצורת טבעת לפני ההשתלה על מנת להיצמד לעין. למטרות זיהוי, היצרן צירף אלקטרודות פעילות בנדן פלסטיק חצי לבן וחצי צבעוני, בעוד אלקטרודות לא פעילות מכוסות בנדן בצבע מלא. אלקטרודת הארקה (מעטפת פלסטיק שקופה) נותרת ללא שינוי עבור כל האלקטרודות הפעילות והלא פעילות לביצוע שלבים 1.1, 1.2, 1.3 ו-1.7.

1. בטל את הסיבוב של אלקטרודת הנירוסטה הדו-גדילית בעזרת שתי צבתות בעלות קצוות עדינים.
2. חתכו את אחד מגדילים מפלדת אל-חלד (כ-1 ס"מ מהקצה), והשאירו גדיל ישר אחד ארוך יותר שנותר לעיצוב אלקטרודת הטבעת.
3. קפלו את גדיל הנירוסטה הבודד בחזרה על עצמו וסובבו, ויצרו טבעת חלקה בקצה האלקטרודה.
4. עבור אלקטרודות פעילות ERG, עצבו לולאה זו ~ בקוטר 0.2 - 0.5 מ"מ על ידי סיבוב בסיס הלולאה (למטרה המתוארת כאן, עצבו שתי אלקטרודות פעילות בדרך זו כדי להקליט ERG משתי העיניים), ועבור אלקטרודות ERG לא פעילות ואלקטרודות VEP הופכות את קוטר הלולאה ~ לקוטר 0.8 מ"מ (בדוגמה זו, בצע זאת עבור אלקטרודת VEP פעילה אחת וכל שלוש האלקטרודות הלא פעילות).
5. חבר את האלקטרודה הפעילה המעגלית VEP סביב בורג נירוסטה (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ) כך שהאלקטרודה תישען על ראש הבורג.
6. חבר את 3 האלקטרודות הלא פעילות (2 ERG, 1 VEP) סביב בורג נירוסטה שני (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ).
7. משוך את שרוול הפלסטיק קדימה מעל הקצוות החדים של שני גדילי הנירוסטה כדי להפחית גירוי.
8. יש לעקר את משדרי הטלמטריה על ידי השרייתם ב-2% גלוטראלדהיד למשך יותר מ-10 שעות בטמפרטורה של כ-25°C. לאחר מכן, שטפו את המשדר במי מלח סטריליים שלוש פעמים.

2. השתלת משדר

1. הכנת בעלי חיים
   1. יש לחטא את אזור הניתוח לפני הניסוי על ידי ניקויו באתנול 70%. Autoclave כל ציוד כירורגי לפני השימוש ולשמור על ציוד chlorhexidine כאשר אינו בשימוש במהלך הניתוח. כסו את בעל החיים עם וילון כירורגי במהלך הניתוח כדי לשמור על סביבה סטרילית. ודא שכל הנסיינים לובשים מסכות כירורגיות, כפפות סטריליות וחלוקים.
   2. יש להשרות הרדמה עם איזופלורן 1.5-2% בקצב זרימה של 3 ליטר/דקה ולשמור על 1.5-2% ב-2 ליטר/דקה לאורך כל הניתוח. ודא עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר רפלקס דוושה בעת צביטת השריר בין אצבעות הרגליים.
   3. יש לגלח שטח בגודל 40X30 מ"מ מעל הבטן מעל המפשעה ועד עצם החזה.
   4. יש לגלח שטח בגודל 30X20 מ"מ מעל המצח, אחורי לעיניים וקדמי לאוזניים.
   5. יש לחטא את שני האזורים המגולחים. עבור אזור המצח יש לחטא עם 10% פובידון-יוד שלוש פעמים (הימנעו משימוש בחומרי חיטוי על בסיס אלכוהול לאזור הקרוב לעין, בהתאם לתקן הנוהג שנקבע על ידי איגוד הטכנולוגים הכירורגיים). מעל הבטן, לחטא עם 10% פובידון-יוד ו 70% אתנול.
   6. יש למרוח טיפה אחת של proxymetacaine על הקרנית להרדמה מקומית נוספת.
   7. יש למרוח טיפה אחת של נתרן carboxymethylcellulose על הקרנית כדי למנוע התייבשות של העיניים.
2. השתלה כירורגית
   1. בצע חתך 10 מ"מ בראש לאורך קו האמצע האנכי בין האוזניים עם אזמל כירורגי.
   2. בצע חתך של 5 מ"מ בבטן דרך שכבת העור לאורך קו האמצע מתחת לחזה.
   3. מנהרה צינורית בקוטר 5 מ"מ תת עורית מחתך הבטן לחתך הראש.
   4. מזינים את חוטי האלקטרודות (3 פעילים ו-3 לא פעילים) של המשדר דרך הצינורית מהבטן לראש.
   5. השאר את אלקטרודת הייחוס עם בסיס המשדר וכסה את קצה האלקטרודה בגזה אספטית.
   6. מכסים את קצות האלקטרודות (3 פעילות ו -3 לא פעילות) בגזה אספטית.
   7. אבטחו את ראשה של החולדה לפלטפורמה סטריאוטקסית.
   8. האריכו את החתך במצח לאורך של 30 מ"מ בעזרת מספריים כירורגיים.
   9. חשוף את אזור הניתוח על ידי נסיגה של עור רפוי עם 2 תפרים (3 - 0) בשעה ~ 3 ו -9.
   10. יש לגרד את הפריאוסטאום שמעל הגולגולת באמצעות גזה מעוקרת כדי לחשוף את התפרים של ברגמה, למבדה וקו האמצע.
   11. קדח שני חורים דרך הגולגולת בקואורדינטות הסטריאוטקסיות VEP פעילות (7 מ"מ גחון לברגמה, 3 מ"מ לרוחב לקו האמצע) ולא פעילות (5 מ"מ רוסטרל לברגמה בקו האמצע).
   12. חבר אלקטרודות פעילות ולא פעילות של VEP עם ברגי נירוסטה מחוברים מראש (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ) לגולגולת באמצעות מברג קטן לעומק ~ 1 מ"מ לתוך החורים שהוכנו מראש. פעולה זו מעגנת את הבורג לעצם מבלי לפגוע ברקמת קליפת המוח שמתחתיה.
   13. כדי להשתיל אלקטרודות פעילות ERG, השתמש בתפר 8 - 0 כדי למשוך את העפעף העליון באופן זמני.
   14. הכנס צינורית 16 עד 21 G תת עורית מאחורי העין עד לפורניקס הלחמית העליון.
   15. הסר את המחט המנחה.
   16. הזינו את האלקטרודה הפעילה דרך צנתר הפלסטיק המקוצר מהמצח לכיוון העין. לאחר מכן, הסר את קטטר הפלסטיק.
   17. השתמש בתפר זמני (8 - 0), אשר מושחל דרך לולאת האלקטרודה, כדי למנוע מהאלקטרודה לסגת חזרה לתוך המנהרה.
   18. בצע חתך של 0.5 מ"מ בלחמית העליונה בשעה 12, 1 מ"מ מאחורי הלימבוס. השתמש בדיסקציה קהה כדי לחשוף את הסקלרה הבסיסית.
   19. השתיל תפר 8 - 0 או 9 - 0 מיד מאחורי הלימבוס בעובי חצי סקלרלי.
   20. הסר תפר זמני מאלקטרודה פעילה ERG.
   21. עגנו את האלקטרודה הפעילה ERG לתפר חצי עובי סקלרלי על ידי קשירת 3 קשרים רצופים, וודאו שקצה האלקטרודה ממוקם קרוב ללימבוס.
   22. סגור את דש הלחמית באמצעות 1 עד 2 תפרים קטועים (8 - 0 עד 9 - 0). ודא כי הלחמית מכסה לחלוטין את אלקטרודת ERG כדי לשפר את הנוחות.
   23. הסר את התפר הנסוג של העפעף.
   24. חזור על ההליך עבור העין הנגדית.
   25. יש למרוח ג'ל ציאנואקרילט על הגולגולת כדי לאבטח את כל ברגי הנירוסטה וחוטי האלקטרודות. ודא שהאלקטרודות הפעילות של ERG אינן נמשכות חזק מדי לפני שאתה מאבטח אותן כדי לאפשר תנועות עיניים.
   26. סגור את פצע הראש באמצעות תפר 3 - 0 שאינו נספג.
   27. סובבו את המכרסם כדי לחשוף את אזור הבטן. האריכו את החתך העורי בבטן עד 40 מ"מ לאורך ה-Linea alba בעזרת מספריים כירורגיים.
   28. בצע חתך של 35 מ"מ דרך דופן השריר הפנימי כדי לחשוף את חלל הבטן הפנימי.
   29. באמצעות שני תפרים (3 - 0), גוף המשדר מחובר לדופן הבטן הפנימית בצד ימין של החיה. הימנע ממגע עם הכבד.
   30. לולאה את אלקטרודת הקרקע ולאבטח אותה בצורה זו עם תפר (3 - 0). לאחר מכן, הניחו אותו צף חופשי בחלל הבטן.
   31. סגור את הצפק באמצעות תפר רציף (3 - 0).
   32. סגור את חתך העור באמצעות תפרים קטועים (3 - 0).
3. טיפול לאחר הניתוח
   1. עקוב אחר בעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. שכן את בעל החיים לבדו לאחר הניתוח.
   2. מתן carprofen תת עורית עבור שיכוך כאבים (5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום במשך 4 ימים.
   3. יש להוסיף אנטיביוטיקה מניעתית דרך הפה (אנרופלוקסין, 5 מ"ג/ק"ג) למי השתייה למשך 7 ימים לאחר הניתוח.
   4. יש למרוח משחה אנטי דלקתית על אתרי חתך בעור כדי להפחית את הגירוי במשך 7 הימים הראשונים לאחר הניתוח.

3. ביצוע רישומי ERG ו-VEP בחולדות מודעות

1. Dark adapt animal במשך 12 שעות לפני הקלטות ERG ו-VEP.
2. בצע את כל המניפולציות הניסיוניות תחת תאורה אדומה עמומה (17.4 cd.m-2, λmax = 600 ננומטר)
3. החל הרדמה מקומית (0.5% proxymetacaine) וטיפות מרחיבות (0.5% tropicamide) על הקרנית.
4. להנחות את המכרסם המודע לתוך מסננת מותאמת אישית וברורה.
   הערה: ניתן לכוונן את אורכו של צינור פלסטיק זה כך שיתאים לחולדות בגדלים שונים, כאשר הקוטר הכולל קבוע ל-60 מ"מ. הקצה הקדמי של המכשיר מחודד כדי למזער את תנועת הראש ומכיל נקבים המאפשרים נשימה תקינה. חזית מחודדת זו מאפשרת יישור וייצוב ראשה ועיניה של החולדה עד לפתח כדור גנצפלד. שימו לב שהמכרסם התאקלם לרסן (3 עד 5 פעמים) לפני הניתוח.
5. מניחים את המכרסם מול קערת גנצפלד כשהעיניים מיושרות עם פתח הקערה.
6. הפעל את המשדר השוכן על ידי העברת מגנט בטווח ~ 5 ס"מ ממנו. לאחר מכן, ודא שהמשדר דולק על ידי בדיקת נורית המצב של נורית ה- LED בבסיס המקלט.
7. לאסוף אותות על פני טווח של אנרגיות זוהרות (כלומר, -5.6 עד 1.52 יומן cd.s.m²).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגבר ביולוגי	אדינסוטרמנטים	ML 135	מגביר אותות ERG ו- VEP
Carboxymethylcellulose נתרן 1.0%	אלרגן	CAS 0009000-11-7	לשמור על הידרציה בקרנית במהלך הניתוח
קרפרופן 0.5%	קבוצת פייזר לבריאות בעלי חיים	CAS 53716-49-7	משככי כאבים לאחר הניתוח, הניתנים עם מלח בהזרקה לחידוש נוזלים
כלורהקסדין 0.5%	מעבדות אוריון	27411, 80085	חיטוי כלי ניתוח
מפעיל ג'ל ציאנואקרילט	רכיבי RS	473-439	מייבש במהירות ג'ל ציאנואקרילט
ג'ל ציאנוקרילט	רכיבי RS	473-423	תיקון ברגי אל-חלד לגולגולת
בור שיניים	סטורץ אינסטרומנטס, באוש ולומב	E0824A	ראש מקדח מיניאטורי בקוטר ~0.7 מ"מ ליצירת חור קטן בגולגולת מעל כל חצי כדור להשתלת ברגי VEP
מקדחה	בוש	סדרת Dremel 300	מקדחה אוטומטית לטרפנינג
אנרופלוקסין	מעבדות טרוי		אנטיביוטיקה מניעתית לאחר ניתוח
המרחב המשלב של גנצפלד	פתרונות פוטומטריים בינלאומיים		ממריץ אור בעיצוב אישי: קוטר 36 מ"מ, צמצם 13 ס"מ
מקלוני גזה	Multigate מוצרים רפואיים Pty בע מ	57-100 ב'	מייבש חתך ניתוחי ומשטח גולגולת חשוף במהלך הניתוח
איזופלורן 99.9%	Abbott Australasia Pty בע מ	CAS 26675-46-7	שם קנייני: Isoflo(TM) אנאסתטיקה אינהלציה. חומר הרדמה נשימתי באיכות פרמצבטית מעורבב עם גז חמצן לניתוח השתלת אלקטרודות VEP
משחת Kenacomb	אספן פארמה Pty בע מ		כדי להפחית גירוי בעור וגירוד לאחר הניתוח
נורות Luxeon LED	פיליפס תאורה ושות'		לגירוי אור, 20 5 וואט ונורות LED 1 וואט אחת, הנשלטות על ידי תוכנת סקופ
מחט (מאקרוכירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	501959	לתפירת ניתוחי בטן וראש, בשימוש בתפר 3-0, מחט עיניים, עיגול 5/16 קצה גודל 1, 15 מ"מ
מחזיק מחט (מאקרוכירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	500224	להחזיק מחט במהלך ניתוחי בטן וראש
מחזיק מחט (מיקרוכירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	555419NT	להחזיק מחט במהלך ניתוח עיניים
צנתר אופטיבה	סמיתס מדיקל אינטרנשיונל בע"מ	16 או 21 גרם	אלקטרודות פעילות בקרנית מנחה מהגולגולת ללחמית
פובידון יוד 10%	סאנופי-אוונטיס	CAS 25655-41-8	שם קנייני: בטדין, חיטוי להכנת העור המגולח לניתוח 10%, 500 מ"ל
מערכת איסוף נתונים Powerlab	אדינסוטרמנטים	ML 785	קבלת אות ממשדר טלמטריה, המשויך לממיר נתוני טלמטריה
פרוקסימטקאין 0.5%	מעבדות אלקון	ע"א 5875-06-9	שיכוך כאבים עיני מקומי
ריסון	קוטום עשה		החלק הקדמי של הרסן מחודד כדי למזער את תנועת הראש, ניתן לכוונן את האורך כך שיתאים לאורך שונה של חולדה, הקוטר הכולל הוא 60 מ"מ.
להב שעיר לעזאזל	ר.ג. ציוד רפואי	SNSM0206	לחתך ניתוחי
מספריים (מאקרוכירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	501225	לחיתוך רקמה על העבדמנים והמצח
מספריים (מיקרו-כירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	501232	לנתח את הלחמית לחיבור אלקטרודות
תוכנת סקופ	אדינסוטרמנטים	גרסה 3.7.6	מפעיל בו זמנית את הגירוי באמצעות מערכת ADI Powerlab ואוסף נתונים
מכונת גילוח	אוסטר	גולדן A5	לגלח פרווה מאזורי ניתוח
ברגי סטרל מנירוסטה	מיקרו-מחברים	L001.003CS304	קוטר פיר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ
מסגרת סטריאוטקסית	דוד קופף	דגם 900	מכשיר סטריאוטקסי בעל חיים קטן לאיתור ציוני הדרך להשתלה בגולגולת
וילונות כירורגיים	ציוד רפואי חיוני	GM29-612EE	להבטיח סביבה סטרילית במהלך הניתוח
תפר (מקרוכירורגיה)	מחטים רפואיות של נינבו	3-0	לתפירת ניתוחי בטן וראש, משי סטרילי קלוע, 60 ס"מ
מחט תפר (מיקרו-כירורגיה)	מחטים רפואיות של נינבו	8-0 או 9-0	לניתוחי עיניים כולל, תפירת אלקטרודה לסקלרה וסגירת פצע לחמית, תפר ניילון, 3/8 עיגול 1×5, 30 ס"מ
ממיר נתוני טלמטריה	DataSciences הבינלאומי	₪20	מאפשר לאות טלמטריה להתממשק עם תוכנה לאיסוף נתונים
מטריצת חילופי נתוני מדידת שימוש	DataSciences הבינלאומי		אוסף נתונים ממשדרים, משויך למקלט
מקלט נתוני מדידת שימוש	DataSciences הבינלאומי	RPC-1	מקבל נתוני טלמטריה ממשדר
משדר טלמטריה	DataSciences הבינלאומי	F50-EEE	משדר טלמטריה 3 ערוצים
טרופיקמיד 0.5%	מעבדות אלקון		התרחבות הקשתית
פינצטה (מאקרוכירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	500092	לתפעל רקמות במהלך ניתוחי בטן וראש
פינצטה (מיקרוכירורגיה)	מכשירים מדויקים בעולם	500342	מניפולציה רקמות במהלך ניתוח עיניים