רישום אלקטרואנצפלוגרפי של התקפים אפילפטיים בחולדות המושרות על ידי אפילפסיה

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הרכבת מכשיר אלקטרודת בדיקה מיקרודיאליזה

1. השתמש באלקטרודה דו-פיתולית בעלת 3 ערוצים (עם אורך חיתוך של לפחות 20 מ"מ של אלקטרודת הרישום ואלקטרודת הארקה באורך 10 ס"מ) וחבר אותה לצינורית מנחה כדי להכין את המכשיר. ראו דוגמאות של אלקטרודות תלת-ערוציות וצינורית מנחה לדיאליזה באיור 1A-1B.
2. הסר (איור 1C) והכנס (איור 1D) את צינורית מנחה המתכת לתוך צינורית הפלסטיק הדמה כמה פעמים לפני השימוש כדי להקל על הסרתה ברגע המעבר שלה לבדיקת מיקרודיאליזה בבעלי חיים.
3. כופפו את החוטים המעוותים של אלקטרודת הרישום פעמיים (איור 1E-1F) כדי ליישר את החוטים עם צינורית הדמה של המדריך וחתכו את קצה האלקטרודה (איור 1G) כך שיהיה ארוך ב-0.5 מ"מ מקצה הצינורית המנחה (איור 1H) באמצעות הקליפר הדיגיטלי.
4. הכינו את עיגול הסיליקון באורך 1 מ"מ (קוטר חיצוני [O.D.] 2 מ"מ, עובי 0.3 מ"מ; איור 1I) והכניסו את קצה צינורית ההנחיה ואת קצה האלקטרודות המעוותות לתוך מעגל הסיליקון באמצעות הפינצטה (איור 1J). קבעו אותו על כף הרגל של כן צינורית ההנחיה בעזרת דבק פולימרי בעל פעולה מהירה או שרף (איור 1K). ראו את הדוגמה של המכשירים שהושלמו באיור 1L ובאיור 2A.
5. יש לעקר את המכשיר תחת אור אולטרה סגול (UV) למשך 4 שעות. להפוך את המכשיר ארבע פעמים כך שכל אחד מצדדיו חשוף לאור למשך 1 שעות
   הערה: אלקטרודות ביתיות רבות ובדיקות מיקרודיאליזה עשויות להיות מורכבות באופן דומה. לראש השתל המתואר לעיל לחולדות יש את הממדים הבאים: רוחב 7 מ"מ x עומק 5 מ"מ x אורך 10 מ"מ מהחלק העליון ועד הבוהן; קצה השתל הוא באורך של כ-11 מ"מ, קוטר של 600 מיקרומטר וכל משקל המכשיר כ-330-360 מ"ג. ניתן לעשות שימוש חוזר במכשיר פעמיים או שלוש אם (i) אורך מספיק של אלקטרודת הקרקע נשאר על הגולגולת במהלך הניתוח לשימוש הבא ו-(ii) כאשר בעל החיים נהרג, והמכשיר התאושש יחד עם המלט הדנטלי הוא נשאר באצטון למשך הלילה, כך שהמלט עשוי להתפרק מכנית, והמכשיר נשטף ועוקר שוב.

2. ניתוח סטריאוטקסי

1. השתמשו במכשיר סטריאוטקסי ובמחזיק תפס בדיקה (איור 2B) להשתלת המכשיר בהתאם לתקנים העכשוויים לניתוחים אספטיים וללא כאב.
   1. הרדימו את חולדות Sprague-Dawley הבוגרות בתערובת קטמין/קסילזין (43 מ"ג/ק"ג ו-7 מ"ג/ק"ג, תוך צפקית) וקיבעו אותה על המסגרת הסטריאוטקסית. הוסף הרדמה איזופלורנית (1.4% באוויר; 1.2 מ"ל/דקה) להזרקת קטמין/קסילזין ראשונית מכיוון שהיא מאפשרת לשלוט בעומק ההרדמה בזמן. לגלח את הפרווה על ראש החיה.
2. יש לספוג את משטח עור הראש בתמיסה על בסיס יוד ואחריה 70% אתנול כדי להכין אותו לניתוח אספטי.
   1. השתילו את מכשיר צינורית-אלקטרודת ההנחיה שהוכן בקדימות (1.1 – 1.5) לתוך היפוקמפוס הגחון הימני באמצעות הקואורדינטות הבאות: מוט אף + 5.0 מ"מ, A – 3.4 מ"מ, L + 4.5 מ"מ, P + 6.5 מ"מ לברגמה. בצע טכניקות סטנדרטיות עבור ניתוחים סטריאוטקסיים.
   2. ודא שהוא אינו מכסה את ברגי העגינה. בעת הרכבתו על המנגנון הסטריאוטקסי, אחוז במכשיר עבור ראש הצינורית המנחה מכיוון שניתן ליישר אותו בקלות למחזיק הבדיקה.
3. יש לעגן את המכשיר לגולגולת באמצעות לפחות ארבעה ברגי אל-חלד המבריחים אותם לעצם הגולגולת (בורג אחד לשמאל ובורג אחד ללוחיות העצם הקדמיות הימניות, בורג אחד לקודקוד השמאלי ובורג אחד ללוחות העצם הבין-קודקודית). הוסיפו טיפה של דבק רקמות כדי לקבע עוד יותר כל בורג לעצם הגולגולת.
   1. מכסים מחצית מחוטי הבורג במלט מטקרילי. מקדמים את קשירת המלט על ידי יצירת חריצים רדודים בעצם כדי להגביר את ההיצמדות.
4. לאחר שקצה המכשיר ממוקם ברקמת המוח, סובב את חוט אלקטרודת הקרקע סביב 3 ברגי עיגון. כסו את כל הברגים המותקנים ואת המכשיר במלט דנטלי.
5. יש לעקוב אחר בעלי החיים במהלך הניתוח ובמשך כשעה לאחר מכן עד שהם זקופים ונעים בכלוב. שמור אותם על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. אפשרו לחולדות להתאושש לפחות 7 ימים לאחר השתלת המכשיר.
6. יש לעקוב אחר בעלי החיים לפחות פעם ביום במשך 3 ימים לאחר הניתוח לאיתור סימני כאב או מצוקה. תן לבעלי החיים קרם אנטיביוטי (gentamycin 0.1%) קרוב לאתר החתך, כדי למנוע את הזיהום ומשכך כאבים (tramadol 5 מ"ג / ק"ג, i.p.) במשך 3 ימים כדי למנוע את הכאב לאחר הניתוח.

3. השראת אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי פילוקרפין והקצאת בעלי חיים לקבוצות ניסוי

1. לאחר שבוע של התאוששות לאחר הניתוח, הקצו את החיות באופן אקראי לקבוצות: (i) חיות בקרה המקבלות רכב ו-(ii) חיות אפילפטיות, שיקבלו פילוקרפין. השתמש במספר גבוה יותר באופן יחסי של בעלי חיים עבור קבוצה אפילפטית מכיוון שלא כל החולדות המנוהלות על ידי פילוקרפין יפתחו את המחלה.
2. יש להזריק מנה של מתילסקופולאמין (1 מ"ג/ק"ג, תת-עורית [s.c.]) ו-30 דקות לאחר מכן, זריקה אחת של פילוקרפין (350 מ"ג/ק"ג, כלומר להשראת סטטוס אפילפטיקוס (SE). הזריקו מתילסקופולמין ואת הרכב (מלוחים) לחולדות הביקורת. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G עבור כל i.p. ממשילות.
   1. בדוק חזותית את החיות כדי להתחיל לקבל התקפים התנהגותיים (להזיז vibrissa בתוך 5 דקות, להנהן בראש, שיבוט הגפיים) ובתוך 25 דקות כדי לשבט ברציפות את כל הגוף (SE).
3. עצור את SE 2 שעות לאחר תחילת התמותה של כ 25% ותקופה סמויה ממוצעת של כ -10 ימים על ידי מתן דיאזפם (20 מ"ג / ק"ג, i.p). יש להתבונן ולתעד כל התנהגות התקף החל מיד לאחר הזרקת הפילוקרפין ולהמשיך לפחות 6 שעות לאחר מכן.
4. תן לבעלי החיים מלח (1 מ"ל, כלומר ) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G ותמיסת סוכרוז (1 מ"ל, p.o.) באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט הזנה גמישה 17G למשך 2-3 ימים לאחר SE כדי לקדם את ההתאוששות של ירידה במשקל הגוף.
   1. אין לכלול את בעלי החיים שאינם משיגים את משקל הגוף הראשוני בשבוע הראשון לאחר פילוקרפין SE מהמחקר (למעט הקבוצה החריפה שנהרגה 24 שעות לאחר SE, שם מעקב אחר משקל הגוף אינו אפשרי).
5. הקצו חיות פוסט-SE באופן אקראי לקבוצות ניסוי שונות (איור 3): שלב אקוטי (שבו המיקרודיאליזה מתרחשת 24 שעות לאחר SE), חביון (7-9 ימים לאחר SE), התקף ספונטני ראשון (כ-11 ימים לאחר SE), ותקופה כרונית (מתחילה כ-22-24 ימים לאחר SE, כלומר כ-10 ימים לאחר ההתקף הראשון). לפקח על בעלי החיים עבור התרחשות של התקפים ספונטניים.
   הערה: השתמש בקריטריוני ההכללה/הרחקה הבאים לניסויים נוספים בחולדות אפילפטיות: התפתחות SE עוויתית תוך שעה לאחר מתן פילוקרפין; עלייה במשקל בשבוע הראשון לאחר SE ואת המיקום הנכון של בדיקת מיקרודיאליזה ואלקטרודה.

4. ניטור וניתוח התנהגות אפילפטית

1. ניטור ארוך טווח של התנהגות אפילפטית
   1. כ-6 שעות לאחר מתן הפילוקרפין (כלומר, בתום תצפית ישירה של החוקרים), הכניסו את החיות לכלובים הביתיים הנקיים והתחילו בניטור וידאו של 24 שעות.
   2. המשך ניטור וידאו 24 שעות עד יום 5, באמצעות מערכת מעקב וידאו דיגיטלית.
   3. החל מהיום החמישי, חברו את החולדות בכלובים המלבניים הביתיים שלהן למערכת הקלטה EEG קשורה והמשיכו בניטור וידאו 24 שעות ביממה.
   4. הגדר את הפרמטרים על המגבר הממוקם מחוץ לכלוב פאראדיי (הגדר גורם הגברה בכל ערוץ בהתאם לספציפיות של אות ה- EEG של כל חיה בודדת) והתחל את רכישת ה- EEG תוך התבוננות באות ה- EEG המופק על ידי כבלים לא מחוברים. השתמש בקצב דגימה של 200 הרץ ובמסנן מעבר נמוך המוגדר ל- 0.5 הרץ.
   5. חבר את בעל החיים לכבלים המחזיקים את ראשו של בעל חיים בין שתי אצבעות מתוחות של יד אחת ומבריחים את המחברים למעמד האלקטרודות באמצעות היד החופשית השנייה. התחל את הרכישה.
      זהירות: ודא שהאות נקי מחפצים. ממצאים נפוצים הם קוצים החורגים בהרבה מהסקאלה.
   6. יום לפני ניסוי המיקרודיאליזה, מעבירים את בעלי החיים למערכת EEG קשורה המצוידת במיכלי פרספקס למיקרודיאליזה. נתקו את בעלי החיים ממערכת קשירת ה-EEG בכלוב הביתי, הבריגו את המחברים מהאלקטרודה מבלי לרסן את החיה. הכניסו את החיה לגלילי הפרספקס הגבוהים.

איור 1. הכנה שלב אחר שלב של המכשיר להשתלה. (A) אלקטרודה תלת-ערוצית עם אלקטרודת הארקה באורך 10 ס"מ בשרוול המגן שלה משמאל וצינורית מנחה למיקרודיאליזה מימין הדרושה להרכבת המכשיר. (B). האלקטרודה החשופה וצינורית ההנחיה בפירוט. הצעד הראשון הוא להסיר את (C) ולהכניס (D) את צינורית הנחיית המתכת מבובת הפלסטיק שלה ובתוכה מספר פעמים כדי להקל על שחרורה לאחר שהושתלה בראשה של החיה. השלב השני הוא לכופף פי שניים את אלקטרודת הרישום המעוותת כדי להיות מיושרת לצינורית מנחה דיאליזה (E, F). (G) יש לחתוך את קצה האלקטרודה כך שיהיה ארוך ב-0.5 מ"מ מקצה צינורית הנחיית המתכת. (H) בדוק את דיוק החיתוך באמצעות הקליפר הדיגיטלי. לאחר מכן, יש להשתמש במעגל סיליקון באורך של כ-1 מ"מ כדי לתקן את יישור האלקטרודה כדי להנחות את רגל הצינורית (I). (J) התצלום המראה כיצד לצלצל באלקטרודה ולהנחות את מוט הצינורית. השלב האחרון הוא לשים טיפת שרף או דבק על כן הצינורית המנחה, ולקבע אליה את עיגול הסיליקון (K). (L) התקן מורכב מוכן לעיקור.

איור 2. צילומים של סוגים שונים של מכשירים למיקרודיאליזה-EEG בחולדות המשמשות (A) ותצלום של מחזיק קליפס הבדיקה (B) המשמש להשתלת מכשירים אלה. (A) צינורית ההנחיה (בירוק) מוחלפת בצינורית מיקרודיאליזה, בדרך כלל 24 שעות לפני הניסוי. המחבר החשמלי של המכשיר (משמאל הראשון שימש להקלטות המתוארות בכתב יד זה) מאפשר חיבור חוטים המוליכים אות חשמלי לציוד מגבר ואיסוף נתונים. המכשיר מחובר בניתוח לגולגולת של חולדות מורדמות וניתן להשיג הקלטות מאוחר יותר מבלי לגרום כאב או אי נוחות בחולדות המתנהגות בחופשיות.

איור 3. תכנון ניסיוני. שבוע לפני השראת סטטוס אפילפטיקוס (SE), החולדות מושתלות במכשיר. SE מושרה על ידי פילוקרפין ובעלי חיים (אם לא מחייגים ומומתים 24 שעות לאחר SE; החולדות מקבוצה חריפה) מנוטרים בווידיאו במשך 5 ימים (קו כחול), ואז מנוטרים בווידיאו-EEG כדי להעריך את תדירות ההתקפים ומשך הזמן בכלובים הביתיים שלהם (קו ירוק). עבור ניסוי המיקרודיאליזה, חולדות הבקרה האפילפטיות והלא-אפילפטיות, בהתאמה, מועברות למערך EEG אחר המצויד בכלובי גליל תוך 24 שעות לפני מפגש המיקרודיאליזה ועדיין מנוטר וידאו EEG (קו ירוק בהיר). הקווים האדומים האנכיים מייצגים את מפגשי הדיאליזה בנקודות זמן שונות של התפתחות מחלות אפילפטיות. הקווים האדומים האופקיים מייצגים את הקבוצות השונות של בעלי חיים אפילפטיים (ובעלי חיים שאינם אפילפטיים בהתאמה), כאשר החץ מציין את היום האחרון של המיקרודיאליזה ואת יום מותו של בעל החיים.