רישום פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררי שדה עצבי בפרוסות היפוקמפוס חריפות

תקציר

מקור: Weng, W., et al. הקלטת פלסטיות סינפטית בפרוסות היפוקמפוס חריפות המתוחזקות במערכת תא מסוג מיחזור, זילוח וטבילה בנפח קטן. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את ההליך להגדרת פרוסת מוח בתא טבילה כדי להקליט פעילות סינפטית. התהליך כולל אבטחת הפרוסה על נייר עדשה, שמירה על זרימה רציפה של נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) כדי להבטיח כדאיות עצבית, ומיקום מדויק של אלקטרודות הגירוי וההקלטה ביחס לאזור מסוים במוח. מערך זה מאפשר ניטור מדויק של הפעילות הסינפטית הבסיסית והשפעות הגירוי החשמלי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הקלטת תגובות סינפטיות בתא פרוסת טבילה

הערה: עיין בטבלת החומרים.

1. מחממים מראש את תמיסת aCSF באמבט מים לכ 28-30 מעלות צלזיוס (זה ימנע היווצרות בועות בתא ההקלטה).
2. הפעל את מערכת המיחזור (4-5 מ"ל/דקה) והפעל את המחמם המוטבע כדי לאזן את המערכת למשך שעה אחת לפחות.
3. השרו פיסת נייר קטנה לניקוי עדשות ורשת ניילון המקובעת על חוט פלטינה בצורת U בתא פרוסת הטבילה למשך מספר דקות (איור 1).
4. הסר את חוט הפלטינה בצורת U.
5. כבו את המיחזור והניחו פרוסה על נייר ניקוי העדשה.
6. הניחו מיד את רשת אחיזת הפרוסה על גבי הפרוסה, הפעילו את המשאבה ותנו לפרוסה להתאזן למשך 30 דקות מבלי לטבול את המטרה ב-aCSF.
7. מלאו את מיקרופיפטת הבורוסיליקט (כלומר, אלקטרודת ההקלטה) ב- aCSF (עמידות חוד: 1-2 MΩ, מלא 1/3 ב- aCSF) והרכיבו אותו במחזיק הפיפטה.
8. הניחו את אלקטרודת גירוי הטונגסטן המבודדת באפוקסי שנבדקה במחזיק המניפולטור ואת חוטי הייחוס בתא הפרוסה.
9. הוסיפו אלקטרודת ייחוס שנייה לתא וחברו אותה לשקע הייחוס של ראש אלקטרודת ההקלטה (איור 1A).
10. בתוכנת בקרת המגבר, לחץ על התיבה "מצב מהדק אפס" והמשך על ידי לחיצה כפולה על התיבה "רשימת רווחי פלט". בחר רווח של "100", לחץ פעמיים על "תיבת רשימת מסננים במעבר גבוה (בסל)", בחר "0.1 הרץ" ולחץ פעמיים על "תיבת רשימת מסננים במעבר נמוך (AC)" כדי לבחור "3 קילוהרץ".
11. בתוכנת ההקלטה, לחץ על "רכוש | פרוטוקול פתוח." בחר פרוטוקול הכולל הגדרות המאפשרות גירויים אפיזודיים ודיגיטליזציה של פוטנציאלים מוגברים במהירות 10-20 קילוהרץ למשך 50-100 אלפיות השנייה, ואשר מפעיל באופן אוטומטי איזולטור גירוי 10 אלפיות השנייה לאחר תחילת הקלטה אפיזודית.
12. מקמו את אלקטרודות הגירוי וההקלטה בקו ובמקביל לשכבת הפירמידל, לדוגמה (איור 1B ואיור 2).
13. לחץ על "רכוש | ערוך פרוטוקול" ובחר בכרטיסייה "טריגר" (בחלון הקופץ). לחץ על התיבה "מקור טריגר" ובחר "מקש רווח" כמקור ההדק. לחץ על הלחצן "אישור". לחץ על כפתור "הקלט" כדי להתחיל את הרכישה ולציין את החלון המוקפץ עם כפתור הדק.
14. בתוכנת מבודד הגירוי, לחץ על התיבה "בקרת מתח" והזן "0". לחץ על כפתור "הורד". לחץ על חלון "תוכנת הקלטה" ולחץ על מקש הרווח. חזור על מחזור זה על ידי הזנת ערכים ברצף מ- 1 עד 8, לדוגמה, בשלבים של 1 mV בתיבה "בקרת מתח".
15. מתאם את חוזק הגירוי עם ערכי שיפוע fEPSP וקבע את חוזק הגירוי הדרוש כדי לקבל 40% ממקסימום שיפוע fEPSP. לחץ על "תיבת בקרת מתח" והזן את הערך שנקבע. לחץ על הלחצן "הורד".
    הערה: מבודד גירוי משמש להחלת פולסי מתח או זרם קצרים על רקמת המוח. הפולסים הדו-פאזיים יכולים להכיל 100 מיקרו-שניות לכל פאזה.
16. בתוכנת ההקלטה, לחץ על כפתור העצירה ולאחר מכן על תפריט "רכישה". לחץ על "ערוך פרוטוקול" ובחר בכרטיסייה "טריגר" בחלון הקופץ. לחץ על תיבת מקור ההדק ובחר את "טיימר פנימי" כמקור ההדק. לחץ על הלחצן "אישור". לחץ על לחצן ההקלטה שמתחיל את ההקלטה האוטומטית של פוטנציאלי שדה כל 30 שניות, לדוגמה. לחץ על כפתור "עצור" לאחר 30-60 דקות.
17. לחץ על תפריט "רכישה", לחץ על "פרוטוקול פתוח", בחר את פרוטוקול האינדוקציה הרצוי של פלסטיות סינפטית, ולחץ על כפתור "אישור". לחץ על כפתור "הקלט" כדי להפעיל אוטומטית את הגירוי וההקלטה בתדר גבוה. לחץ על הלחצן "עצור".
    הערה: במקרה של מחקרים הנוגעים לפלסטיות סינפטית, יש ליישם את אחת מפרדיגמות האינדוקציה הסטנדרטיות להגברה לטווח ארוך או דיכאון לטווח ארוך לאחר רישום בסיס ממושך. דוגמאות מייצגות של אפנון השידור הסינפטי המתקבל מתוארות באיור 4 ובאיור 5.
18. בתוכנת ההקלטה, לחץ על "רכוש | פתח פרוטוקול" ובחר את אותו פרוטוקול כמו בשלב 4.12. לחץ על הלחצן "אישור" ולאחר מכן לחץ על "הקלט". המשך להפעיל באופן אוטומטי את הקלטות פוטנציאליות בשדה למשך 2-4 שעות, למשל. לחץ על כפתור "עצור" כדי לסיים את ההקלטה.
19. במקרה של מחקרים פרמצבטיים, יש למרוח את התרכובת ישירות על מאגר aCSF אם יש צורך במתן קבוע של תרכובת (איור 3).

תוצאות

איור 1: מרכיבים של זרימה החוצה-קרבוגנציה עבור ניסויים בתא פרוסה שקוע. (א) הצגת תא פרוסת הטבילה. מתואר חוט פלטינה בצורת U עם סיבי ניילון המחזיקים פרוסת היפוקמפוס. חוטי הכסף נכרכו סביב צינורית קטנה, ויצרו סליל כדי להגדיל את שטח קצה חוט הכסף. חוט הייחוס לגירוי הונח בתא היציאה, וההתייחסות להקלטה הייתה בחדר הראשי. כדי לשמור על פוטנציאל אלקטרודת הייחוס יציב ברמות נוזל שונות, ניתן לבודד את ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד וחומרים אלקטרופיזיולוגיים
מושך פיפטה אנכי	Narishige, יפן	PC-10
טבלת בידוד רעידות	Meirits, יפן	ADZ-A0806
תא הקלטה מסוג שקוע	וורנר אינסטרומנטס	RC-26GLP
אמבט מים תרמוסטטי	Zhongcheng Yiqi, סין	HH-1
4 מיקרומניפולטור ציר	Sutter, ארצות הברית	MP-285, MP-225
חוט פלטינה	מכשירים מדויקים בעולם	PTP406
מגבר	התקנים מולקולריים, ארה"ב	Multiclamp 700B
מערכת איסוף נתונים	התקנים מולקולריים, ארה"ב	Digidata 1440A
תוכנת Anaysis	התקנים מולקולריים, ארה"ב	קלמפקס 10.2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Nikon, יפן	FN1
מקור אור LED	Lumen Dynamics Group, קנדה	X-cite 120LED
מיקרופיפטות	מכשיר הרווארד	GC150TF	הקלטה חוץ-סלולרית
מיקרופיפטות בורוסיליקט	Sutter, ארצות הברית	BF150-86	מהדק טלאי
אלקטרודת טונגסטן	A-M Systems, ארה"ב	575500
משאבה פריסטלטית	Longer, סין	BT00-300T
צינורות למשאבה פריסטלטית	ISMATEC, Wertheim, גרמניה	SC0309	1x inflow, ID: 1.02mm
צינורות למשאבה פריסטלטית	ISMATEC, Wertheim, גרמניה	SC0319	2x צינורות ליציאה, ID: 2.79 מ"מ
מצלמת CCD	PCO, גרמניה	pco.edge sCMOS
נייר ניקוי עדשות	קודאק
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי	תרמו-מדעי	339652
חדר קדם	וורנר אינסטרומנטס	BSC-PC
מחמם מוטבע	וורנר אינסטרומנטס	SF-28
בקר טמפרטורה	וורנר אינסטרומנטס	TC-324B
ריאגנטים נדרשים
NaCl	מגיב כימי סינופארם, סין	10019318
KCl	מגיב כימי סינופארם, סין	10016318
KH2PO4	מגיב כימי סינופארם, סין	10017618
MgCl2·6H2O	מגיב כימי סינופארם, סין	10012818
CaCl2	מגיב כימי סינופארם, סין	10005861
NaHCO3	מגיב כימי סינופארם, סין	10018960
גלוקוז	מגיב כימי סינופארם, סין	10010518
נה"ה 2ת.ד. 4	מגיב כימי סינופארם, סין	20040718
HEPES	סיגמא	H3375
נתרן פירובט	סיגמא	A4043
מגסו4	מגיב כימי סינופארם, סין	20025118
נאוה	מגיב כימי סינופארם, סין	10019718