רישומים אלקטרופיזיולוגיים של תכשירי גזע המוח-חוט השדרה ממכרסם שזה עתה נולד

תקציר

מקור: רוסו, י. ואח' אלקטרופיזיולוגיה על תכשירי גזע מוח-עמוד שדרה מבודדים ממכרסמים שזה עתה נולדו מאפשרת רישום פלט של רשת הנשימה העצבית. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תכשירי גזע מוח-עמוד שדרה מבודדים ממכרסמים שזה עתה נולדו. התכשיר ממוקם בתא הקלטה, ופרצי ההשראה מגזע המוח נרשמים בתנאים מחומצנים וחסרי חמצן באמצעות שורש העצב הגחוני הרביעי בחוט השדרה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הגדרה והכנה

1. פתרונות
   1. הכינו תמיסות מלאי מלאכותיות של נוזל מוחי שדרתי (aCSF) לפי המתכונים הבאים. מתכונים אחרים עם וריאציות ריכוז זמינים בספרות. אחסן פתרונות מלאי ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד.
      1. תמיסת מלח: להוסיף 75.39 גרם של NaCl (129 mM סופי); 2.5 גרם של KCl (3.35 mM סופי); 0.81 גרם של NaH₂PO4 (0.58 mM סופי); 2.33 גרם של MgCl₂ (1.15 mM סופי); 1.85 גרם של CaCl₂ (1.26 mM). יש להמיס ב-800 מ"ל מים מזוקקים ולאחר מכן למלא עד 1 ליטר במים מזוקקים.
      2. תמיסת ביקרבונט: להוסיף 17.65 גרם של NaHCO₃ (21 mM סופי). יש להמיס ב-900 מ"ל מים מזוקקים ולאחר מכן למלא עד 1 ליטר במים מזוקקים. שינויים בריכוז הביקרבונט יגרמו לשינויים ב-pH.
      3. תמיסת גלוקוז: להוסיף 54.06 גרם גלוקוז (30 mM סופי). ממיסים ב-400 מ"ל מים מזוקקים וממלאים עד 500 מ"ל במים מזוקקים.
   2. הכן aCSF על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת מלח, 100 מ"ל של תמיסת ביקרבונט, ו 50 מ"ל של תמיסת גלוקוז ב 1 ליטר של מים מזוקקים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
   3. הכינו אלקטרודת זכוכית על ידי חימום ומתיחה של צינור זכוכית עד שהוא נשבר. יש לטשטש את הקצה לפני השימוש. ניתן לעשות שימוש חוזר באלקטרודה פעמים רבות כל עוד היא נשארת נקייה.
2. התקנה ניסיונית
   הערה: פרטי המערך מוצגים באיור 1.
   1. הפעל את המגבר, הממוצע הנע, מערכת איסוף הנתונים, בקר הטמפרטורה והמשאבה. בדוק את הגברת האות (רווח = 10,000), את הסינון (סף נמוך, 10 הרץ; סף גבוה, 5 קילוהרץ), ואת קצב הדגימה של ההמרה האנלוגית לדיגיטלית של האות הגולמי (2.5 קילוהרץ).
   2. מלאו בקבוק ב-aCSF ובעבעו אותו בקרבוגן (95% O₂, 5% CO₂). השראת זרימה aCSF מבעבעת ומחוממת בתא ההקלטה (נפח 5 מ"ל) ב-4 מ"ל/דקה. החזק את הטמפרטורה בתא ההקלטה ב 26 (± 1) ° C. pH צריך להיות 7.4 בתנאים סטנדרטיים אלה.
   3. יש לשמור 50 מ"ל של טמפרטורת החדר (RT) ו-aCSF מבעבע קרבוגן במזרק של 50 מ"ל ליד תא הנתיחה.
   4. הפעל את המחשב והפעל את תוכנת ההקלטה.

2. דיסקציה

1. לשקול ולקבוע חזותית את המין של החיה (לזכרים יש מרחק אנו-איברי מין ארוך יותר, בעוד שלנקבות יש מרחק אנו-איברי מין קצר; איברי המין הזכריים הם לעתים קרובות כהים בעוד שאיברי המין הנקביים ורודים).
2. להרדים את המכרסמים שזה עתה נולדו על ידי אחת מהאפשרויות הבאות: cryoanesthesia (לחלוטין לטבול את החיה בקרח במשך 4 – 5 דקות), הזרקה (equitensine ב 4 מ"ל / ק"ג) או שאיפת של חומרי הרדמה נדיפים (isoflurane או אתר). לאשר מישור נאות של הרדמה על ידי היעדר רפלקס נסיגה כפות.
3. הניחו את החיה על הספסל, הגחון עם הפנים כלפי מטה. חתכו את החלק הרוסטרלי של הראש באופן קורונלי בעזרת אזמל ברמת הברגמה (הנראה דרך העור והגולגולת). בצע שלב זה מיד לאחר שהחיה מורדמת.
4. חתך את הגוף באופן קורונלי עם אזמל מתחת לאיברים הקדמיים.
5. הסר עור, שרירים, רקמות שומן וויסקוס עם מספריים כירורגיים ודקים וצבת. מכיוון שהעצמות רכות בגיל זה, היזהרו שלא לפגוע במערכת העצבים. בצע שלב זה על הספסל.
6. מניחים את ההכנה בתא הנתיחה. השתמש aCSF מאוחסן מזרק כדי לחמצן את ההכנה. מנקודה זו ועד סוף ההקלטה, השתמש במיקרוסקופ.
7. על הפן הגבי של התכשיר חותכים את הגולגולת והחוליות מהרוסטרל לחלק הקאודלי לאורך הציר הבינוני בעזרת מספריים וצבת כירורגיים ודקים. פתח את הגולגולת והחוליות החתוכות על מנת לחשוף את רקמת העצבים. השתמש aCSF מאוחסן מזרק כדי לחמצן את ההכנה.
8. בעזרת הצבת, הסר את הממברנה הארכנואידית, רקמה דקה המכסה את פני השטח של רקמת העצבים. שמור על pia mater וכלי הדם כנגד רקמת העצבים. השתמש aCSF מאוחסן מזרק כדי לחמצן את ההכנה.
9. מניחים את התכשיר כשפניו כלפי מטה, ומורידים בזהירות את גזע המוח וחוט השדרה על ידי חיתוך העצבים ורקמת החיבור עם המספריים תוך החזקת התכשיר במקומו. גישה גבית אפשרית גם כן. שמור על השורשים והעצבים זמן רב ככל האפשר. הסר את העצמות כדי לבודד את גזע המוח ואת חוט השדרה. השתמש aCSF מאוחסן מזרק כדי לחמצן את ההכנה.
10. הסר את המוח הקטן ואת המבנים הרוסטרליים הנותרים על ידי חתיכתם עם אזמל. השתמש aCSF מאוחסן במחט כדי לחמצן את התכשיר.
11. אופציונלי בהתאם לתכנון ניסיוני, להסיר את pons עם אזמל על ידי חתך העטרה הקדמי לעורק המוח הקטן התחתון. שימו לב ששמירה על כל הפונס תאט את הקצב בחולדות ותעכב אותו לחלוטין בעכברים. תכשירים הכוללים רק את החלק הקאודלי של הפונס מציגים פעילות דמוית נשימה עם תדר יציב בשורש C4.

3. הקלטה

1. מניחים את ההכנה בתא ההקלטה, הגחון עם הפנים כלפי מעלה. תקן את ההכנה עם סיכות בחלק התחתון של חוט השדרה ואת החלק הרוסטרלי ביותר של גזע המוח.
2. באמצעות מזרק המחובר לאלקטרודה על ידי המחט שלה, לגרום שקע באלקטרודה (קוטר קצה זכוכית: 150 - 225 מיקרומטר) על ידי שליפת בוכנה מזרק, על מנת למלא חלקית את האלקטרודה עם aCSF.
3. באמצעות מיקרומניפולטור, מניחים בזהירות את האלקטרודה קרוב לאחד משורשי הגחון הרביעי. שורשים גחונים אחרים יכולים גם הם להציג פעילות דמוית נשימה (למשל, עצב גולגולתי XII, שורש גחון C1).
4. לגרום לשקע במיכל האלקטרודות דרך המזרק על ידי שליפת הבוכנה על מנת לשאוף בעדינות את שורש העצב. לאחר מכן הזז בזהירות את האלקטרודה כדי להחיל אותה על חוט השדרה.
   הערה: באופן אידיאלי, גודל השורש תואם את גודל פתח האלקטרודה ובכך יוצר אטימה בין התאים הפנימיים והחיצוניים של האלקטרודה. מכיוון שמגברים דיפרנציאליים משמשים בדרך כלל להקלטות כאלה, כל פתח בין פנים האלקטרודה לתא ההקלטה מפחית את איכות האות ומקשה על סילוק רעשי רקע.
5. התחל את ההקלטה.
6. רשום את המקצב המיוצר על ידי ההכנה בתנאים נורמוקסיים (כלומר, aCSF מבעבע עם קרבוגן: 95% O₂ ו 5% CO₂) במשך 20 דקות לפחות כדי לקבוע את הפרמטרים הבסיסיים של ההכנה.
7. העבר את הזילוח מ- aCSF מבעבע קרבוגן לגירוי aCSF (כלומר, מבעבע עם 95% N₂ ו- 5% CO₂ לגירוי היפוקסיה) למשך 15 דקות. שנה את משך החשיפה בהתאם לפרוטוקול הניסוי. רשום את משך החשיפה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי החיים. השתמש בצינורות נירוסטה בין בקבוק aCSF לבין התא במידת האפשר כדי למנוע דיפוזיה של גז לחלק החיצוני של הצינור.
8. החזירו את הזילוח ל-aCSF סטנדרטי עם בועת קרבוגן למשך 15 דקות לפחות להקלטת התאוששות. רשום זאת בגיליון נתוני ההקלטה ובעלי החיים.
9. סיים את ההקלטה.

תוצאות

איור 1. סכימה רספקטולטיבית של ההתקנה.ה-aCSF המבעבע מחומם ונשלח על ידי משאבה בתא ההקלטה. עודף aCSF בתא ההקלטה נשאף על ידי משאבה ומושלך. תא ההקלטה מחובר לקרקע ולבקר הטמפרטורה. פלט האלקטרודה מועבר ישירות למגבר, לאחר מכן לממוצע הנע ולמערכת איסוף הנתונים, ולבסוף למחשב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סילגארד	סיגמא אולדריץ'	761036-5EA	לשימוש מתחת למכסה המנוע
NaCl	ביושופ	SOD002
KCl	ביושופ	POC888
CaCl2	ביושופ	CCL444
MgCl2	ביושופ	MAG510
NaHCO3	ביושופ	SOB999
נה"ה 2ת.ד. 4	ביושופ	SPM306
D-גלוקוז	ביושופ	GLU501
קרבוגן	לינדה	343-02-0006
בקר טמפרטורה	וורנר אינסטרומנטס, המדן, קונטיקט, ארה"ב	TC-324B
אלקטרודת יניקה	A-M Systems, אוורט, WA, ארה"ב (ארצות הברית)	דגם 573000
מגבר AC דיפרנציאלי	A-M Systems, אוורט, WA, ארה"ב (ארצות הברית)	דגם 1700
ממוצע נע	CWE, ארדמור, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	דגם MA-821
מערכת איסוף נתונים	Dataq Instruments, אקרון, אוהיו, ארה"ב (ארצות הברית)	דגם DI-720
תוכנת LabChart	ADInstruments, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה"ב (ארצות הברית)
פריזמה sofware	Graphpad, לה ג'ולה, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)
תא הקלטה	תוצרת בית
בסיס	Kanetec, Bensenville, IL, ארה"ב (ארצות הברית)
מיקרומניפולטור	World Precision Instrument Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	מ"ב
בסיס	Kanetec, Bensenville, IL, ארה"ב (ארצות הברית)	קיט-ר
משאבה פריסטלטית	גילסון, מידלטון, ויסקונסין, ארה"ב (ארצות הברית)	מ"ב
פאראדיי קייג'	תוצרת בית	מיניפולס 3
מחשב