יצירת תנודות גמא מקומיות של Cornu Ammonis 1 (CA1) באמצעות גירויים טטניים בפרוסת מוח בהיפוקמפוס

תקציר

מקור: Hatch, R. J., et al. דור של תנודות Ca1 γ מקומיות על ידי גירוי טטני. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תנודות גמא CA1 מקומיות בפרוסת מוח של עכבר היפוקמפוס CA1 באמצעות סימולציות טטניות. שיטה זו חשובה להבנת פעילות הרשת העצבית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הגדרה לחיתוך פרוסות מוח

1. הכינו תמיסת חיתוך המורכבת מ-(mM) 125 כולין-Cl, 2.5 KCl, 0.4 CaCl₂, 6 MgCl₂, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 20 D-glucose רווי בגז קרבוגן (95% O_2-5% CO₂) ותמיסת רישום נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) המורכבת מ-(mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 10 D-glucose, רווי בקרבוגן. מניחים את תמיסת החיתוך על קרח כדי לשמור על קור.
2. מקפיאים כ-400 מ"ל מתמיסת החיתוך ומערבבים יחד עם 100 מ"ל של תמיסת חיתוך לא קפואה ליצירת תמיסת קרח. בועה עם קרבוגן (95% O_2-5% CO₂) בזרימה של כ 0.5 ליטר / דקה דרך צינורות קליבר קטן או זכוכית מסונטרת כדי לייצר זרימה יציבה אך עדינה של בועות.
3. הכינו של 250 מ"ל עם רשת ניילון מוגבהת שעליה יונחו פרוסות המוח. ממלאים ב-aCSF כדי לכסות את הרשת בכ-2 ס"מ ומבעבעים בקרבוגן, כדי להבטיח שהבועות לא יפריעו ישירות לאזור האחיזה של הפרוסה. חשוב גם שלא יהיו בועות אוויר ברשת הניילון, כך שאם קיימות כאלה הסירו אותן. זה יהיה תא ההחזקה והוא נשמר ב RT (20 - 25 ° C).
4. פרסו את כלי הניתוח כולל זוג מספריים גדול, זוג מספריים קטנים, מריות מיקרו קטנות וגדולות, וזוגות מלקחיים גדולים וקטנים וצננו אותם על קרח. מניחים את גוש חיתוך רקמת הוויברטומה על קרח על ריבוע של רדיד אלומיניום. השג 2 חתיכות נייר פילטר בקוטר 6 ס"מ, סכין גילוח בעל קצה אחד, וכוס בנפח 25 מ"ל מלאה גם בתמיסת החיתוך.
5. ממלאים מיכל שני בקרח, מניחים פיסת נייר טישו על הקרח ומניחים עליו צלחת תרבית בקוטר 12 ס"מ. ממלאים את צלחת התרבית בתמיסת חיתוך, תמיסת קרח ומבעבעת בקרבוגן. זהו המיכל שבו מתבצעת הדיסקציה המוחית.
6. הכינו את הוויברטום. הסר סכין גילוח פיפיות טרי (השתמש בלהב טרי בכל פעם) מהעטיפה שלו ורסס עם 80% אתנול ולאחר מכן מים שעברו דה-יוניזציה. חותכים פיפטה העברת פלסטיק 3 מ"ל בנקודה שבה היא מתחילה להתחדד. זה ישמש להעברת פרוסות מוח. כופפו מחט 27 גרם בבסיס בכ-45 מעלות וחברו למזרק בנפח 1 מ"ל. זה ישמש כדי לתפעל פרוסות במהלך החיתוך.

2. חיתוך פרוסות מוח

1. הרדימו עכבר (P16-P18) עם 2% איזופלורן או שיטה מאושרת מקומית. לאחר הזירוז, ערפו את ראשו של בעל החיים עם זוג מספריים גדול ושחררו את הראש לתוך צלחת תרבית בקוטר 12 ס"מ המכילה תמיסת חיתוך מבעבעת. הבוצה חייבת לטבול לחלוטין את הראש לקירור מהיר.
2. החזיקו את החלק הקדמי של הראש ביד אחת מקלפת את העור ואת רקמת החיבור קדימה לכיוון האף. בעזרת המספריים הקטנים חותכים את רקמת החיבור כדי לחשוף את הגולגולת שמתחתיה. לאחר מכן הסר את השרירים מעל האספקט הגבי של הגולגולת והצוואר.
3. הוציאו את המוח מהגולגולת על-ידי אבטחת החלק הקדמי של הגולגולת עם המלקחיים הגדולים, ולאחר מכן בצעו שני חתכים רוחביים דרך העצם משני צדי הפתח מגנום באמצעות המספריים הקטנים (איור 1, חתכים המסומנים A1 ו-A2).
   1. בצעו חתך נוסף בין העיניים (רק החלק הקדמי של הברגמה) (איור 1, חתכו מסומן B) ואז חתכו בזהירות לאורך תפר הקשת הקדמי ושיקפו את חלקי הגולגולת החתוכים כדי לחשוף את המוח (איור 1, חתך המסומן C).
   2. השתמשו במרית הקטנה כדי להוציא את המוח ולהניח על צלחת תרבית. היו מודעים לעצבים הגולגולתיים באספקט התחתון של המוח שיהיה צורך לקטוע, ניתן לעשות זאת באמצעות מיקרו מרית בגודל קטן יותר. בעזרת המרית הגדולה יותר מעבירים את המוח לכוס של 25 מ"ל המלאה בתמיסת החיתוך.
4. הכנת חצי המוח לחיתוך.
   1. הניחו חתיכה אחת מנייר הסינון בקוטר 6 ס"מ בתחתית צלחת תרבית טרייה, ומלאו בתמיסת חיתוך טרייה, תמיסת תמיסת תמיסת בועה ובועות. השתמש במרית הגדולה יותר כדי למקם את המוח, הצד הגחוני כלפי מטה, על נייר המסנן. קחו סכין גילוח חדש ונקי בעל קצה אחד וחתכו את המוח כדי להסיר את המוח הקטן, ואז בצעו חתך לאורך קו האמצע כדי להפריד את המוח לשתי המיספרות.
5. הכנת בלוק רקמת הוויברטום.
   1. קחו את בלוק רקמת הוויברטומה הצוננת, ייבשו את פני השטח והניחו טיפה של דבק ציאנואקרילט באמצע, ופזרו באופן שווה לגודל המשוער של המוח. השתמשו במרית הקטנה כדי לתמרן את אחת מהמיספרות המוח אל מרית המיקרו הגדולה כך שהצד המדיאלי של המוח יהיה למטה.
   2. גע בקצה המרית בממשק המוח על פיסת נייר הסינון השנייה כדי להסיר כמה שיותר מהתמיסה . החליקו את המוח מהמרית הגדולה יותר באמצעות המרית הקטנה יותר כדי להנחות אותו על הדבק.
   3. אבטחו את בלוק החיתוך לתוך תא הוויברטום ומלאו את התא בתמיסת חיתוך ובועות, כדי להבטיח שהמוח שקוע לחלוטין. סובבו את גוש החיתוך כך שהצד הגחוני של המוח פונה אל הלהב.
6. חיתוך המוח.
   הערה: כל ויברטומה היא ייחודית, לכן עקבו אחר הוראות היצרן.
   1. כוונו את עובי הפרוסה ל-450 מיקרומטר, וודאו שהלהב רוטט בזמן שהוא נע במוח במהירות של כ-0.3 מ"מ לשנייה. חתכו לחלוטין דרך המוח מהצד הגחוני אל פני קליפת המוח, זה ייצור פרוסות קשת שלמות במוח שניתן להשתמש בהן לרישומים אלקטרופיזיולוגיים. פרוסות יופקו לרוחב עד מדיאלי ובדרך כלל ניתן לחתוך 3 - 4 פרוסות מכל חצי כדור.
   2. אם בסיס הפרוסה מתרומם, השתמשו במחט הכפופה 27 G כדי ללחוץ בעדינות על הפרוסה חזרה למטה. כאשר כל פרוסה נחתכת, השתמש בפיפטת ההעברה כדי להעביר אותה לרציף בתא האחיזה, שם הם קיימא עד 8 שעות.

3. הקלטות אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית

1. הרכבת הפרוסה בתא ההקלטה.
   1. באמצעות פיפטת ההעברה, מניחים פרוסת מוח לתוך תא הקלטה שקוע מחורר עם aCSF זורם ב 1 - 2 מ"ל / דקה ומחומם ל 32 ° C. ה- aCSF המשמש להקלטות שונה מזה שבתא האחיזה מכיוון שריכוז Mg²⁺ גדל מ -2 mM ל -4 mM.
   2. מהדקים את הפרוסה בעזרת "נבל" (נירוסטה חצי עגולה עם גדילי ניילון מתוחים לרוחב במרווח של 2 - 3 מ"מ). הניחו את הנבל כך שהגדילים יפעלו במקביל ל-CA1. הגדל את מהירות הזילוח ל 8 - 10 מ"ל / דקה ב 32 ° C.
2. תחת מיקרוסקופ מנתח הניחו אלקטרודה מעוררת ואלקטרודת הקלטה (אלקטרודת זכוכית מלאה בתמיסת ההקלטה aCSF) על פני השטח של רדיאטום השכבה של CA1 (איור 2A). מקם תחילה את האלקטרודה המגרה ולאחר מכן מקם את אלקטרודת ההקלטה.
3. עוררו את בטחונות שפר עם משרעת של 120 - 150 μA ופולס בדיקה של משך 0.1 msec והתבוננו בצורת הגל של פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר שדה (fEPSP) כדי לקבוע את בריאות הפרוסה (איור 2B). ייתכן שיהיה צורך להעביר את אלקטרודות הגירוי וההקלטה לתוך הפרוסה בערך 50 - 100 מיקרומטר מפני השטח של הפרוסה כדי לקבל הקלטת fEPSP עם מטח סיבים קטן ומשרעת גדולה. הבטחונות המעוררים של שפר הם סטריאוטיפיים ומספקים אינדיקטור טוב לבריאות הפרוסה. פרוסות בריאות מציגות בדרך כלל יחס משרעת סיבים למשרעת fEPSP של פחות מ-0.3.
4. מיקום מחדש של האלקטרודות.
   1. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, הזיזו את האלקטרודה המגרה למרכז שכבת ההקלטה והזיזו את אלקטרודת הרישום לשכבת התא הפירמידלית קרוב ככל האפשר לאלקטרודת ההקלטה, כפי שמוצג באיור 3A. ייתכן שיהיה צורך לדחוף את אלקטרודות הגירוי וההקלטה לתוך הפרוסה בערך 50 - 100 מיקרומטר, כך שמשרעת התגובה fEPSP לפעימת הבדיקה של 120 - 150 μA היא בערך 1 mV.
5. יצירת תנודות γ.
   1. כדי ליצור תנודות γ, לעורר את הרקמה עם רכבת של 20 x 0.1 msec פולסים נמסר ב 200 הרץ. גירוי טטני זה יכול להניב תגובות הניתנות לשחזור כאשר הוא מועבר כל 5 דקות.
6. השתמש בפרמטרי ההקלטה הבאים.
   1. שנה את קנה המידה של אות הפלט כך שיתאים לטווח מתח הכניסה של הממיר האנלוגי-לדיגיטלי. ודא שסיור האות המרבי הצפוי משתמש במינימום של 30% מטווח מתח הכניסה. היזהר בעת הגדרת רווחים גבוהים מדי, מכיוון שהאותות עלולים להיחתך. רוחב הפס האופייני הדרוש להקלטות שדה הוא 500 הרץ עם צימוד AC ב- 0.1 הרץ כדי להסיר סחף מקו הבסיס.
   2. בצע דיגיטציה מהירה פי 4 עד 5 לפחות מתדר הפינה של מסנן המעבר הנמוך כדי למנוע כינוי אות.

תוצאות

איור 1. סכמה של הגולגולת והעור שמעל מראה את מיקום החתכים כדי לחשוף את המוח. A1, A2, B ו- C מסמנים את מיקומי החתכים שיש לבצע כדי לפתוח את הגולגולת להסרת המוח.

איור 2. מיקום האלקטרודות הממריצות והמקליטות בבטחונות CA1 Schaffer לבדיקת תקינות הפרוסה. (A) מר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4-(N-אתיל-N-פנילמינו)-1,2 דימתיל-6-(מתילאמינו) פירימידיניום כלוריד (ZD7288)	סיגמא-אולדריץ'	Z3777
ביוקולין	סיגמא-אולדריץ'	14340
6-ציאנו-7-nitroquinoxa- קו-2,3 דיון (CNQX)	סיגמא-אולדריץ'	C127
ניקל	סיגמא-אולדריץ'	266965
קרבמזפין	סיגמא-אולדריץ'	C4024
(2R)-אמינו-5-פוספונופנטנו אכל (APV)	טוקריס ביוסיינס	105
רטיגבין	ChemPacific	150812-12-7
כולין-Cl	סיגמא-אולדריץ'	C1879-5KG
KCl	סיגמא-אולדריץ'	P9333-500G
NaH2PO4	סיגמא-אולדריץ'	S9638-250G
NaHCO3	סיגמא-אולדריץ'	S6297-250G
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S7653-5KG
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270-1 ק"ג
CaCl2.2H2O	סיגמא-אולדריץ'	223506-500ז
MgCl2.6H2O	סיגמא-אולדריץ'	M2670-500G
אלקטרודה זכוכית	מכשיר הרווארד	GC150F-10
אלקטרודת מתכת מגרה דו-קוטבית קונצנטרית	FHC	CBBPF75
מבודד דיגיטלי	קבלת מכשירים	דגם BJN8-9V1
דגם 1800 מגבר	מערכות A-M	דגם 1800 מגבר
דיגיטציה	חדירות לאומיות	NI USB-6211
ויברוטו	לייקה	VT1200s