רישום אלקטרורטינוגרמה בצימוד ישיר של אפיתל פיגמנט הרשתית בעכבר

תקציר

מקור: Miyagishima, K. J., et al. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) לרישום התגובות החשמליות מעוררות האור של אפיתל פיגמנט הרשתית של העכבר. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים הקלטה של אלקטרורטינוגרמה מצומדת ישירה (DC-ERG) על אפיתל פיגמנט רשתית של עכבר מותאם כהה ומורדם (RPE). לאחר החלת טיפות מרחיבות, החיה ממוקמת במערך הקלטה, והאלקטרודה הנימית המלאה בחיץ מלח ממוקמת על הקרנית. לאחר הקמת קו הבסיס, DC-ERG נרשם.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מיקום עכבר ואלקטרודה

1. שמרו את העכברים למשך הלילה בקופסה מאווררת היטב ואטומה לאור להסתגלות חשוכה.
2. בעלי החיים הורדמו על ידי הזרקה תוך צפקית של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (8 מ"ג/ק"ג).
3. החל טיפה של 0.5% proparacaine HCl מקומי כדי להרדים את הקרנית, כמו גם טיפה של 2.5% phenylephrine HCl ו 0.5% tropicamide כדי להרחיב את התלמידים.
4. חתוך את שפם העכבר עם מספריים כדי למנוע עוויתות בשוגג להפריע אלקטרודות נימי זכוכית במהלך ההקלטה.
   הערה: פרוטוקול הגירוי Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) במערכת ERG כולל מספר שגרות גירוי מובנות שניתן לבחור על ידי לחיצה על Step (חץ קדימה) או Step (חץ אחורה). רק שלבים 1, 4 ו- 5 בתוכנה נדרשים כדי להכין ולבצע את הקלטת DC-ERG.
5. במערכת ERG, התוכנה מוודאת שנבחר המטופל הנכון. לחץ על כפתור הפרוטוקולים הירוק. תחת תיאור פרוטוקול, בחר DC-ERG. לאחר מכן לחץ על הפעל. ודא שזוהי הבדיקה הנכונה המבוצעת על-ידי לחיצה על כן.
6. השתמש בשלב 1/6 המיועד לגירוי אור אדום, כדי להדליק את האור האדום בתוך הכיפה כדי לעזור למקם את העכבר והאלקטרודות תוך התבוננות בשינויים בעכבה.
7. הניחו את העכבר על שולחן הקלטה מחומם ואוהל בזהירות את עור הרגל האחורית באמצעות מלקחיים. החזק את אלקטרודת המחט בחוזקה ביד אחת והכנס אותה תת עורית לרגל האחורית כדי לאבטח אותה למקומה.
8. הניחו את אלקטרודת הייחוס Silver/Siverchloride(Ag/AgCl) (טבלת חומרים) בתוך הפה, כך שהגלולה המסונטרת מונחת לאורך הלחי האחורית ומוחזקת במקומה מאחורי השיניים.
   הערה: אין להשתמש באלקטרודות חוט זהב כאלקטרודת הייחוס לפה מכיוון שיש להן מאפייני עכבה שונים והן מגבירות את רעש השיא לשיא.
9. לפני הנחת האלקטרודות הנימיות לעין העכבר, החזק את מחזיק האלקטרודות עם נימי הזכוכית במאונך והחלק את מחזיק האלקטרודות עם האצבע המורה כדי להסיר בועות שאולי נוצרו. מלאו את הקצה בתמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס באמצעות מחט 25 גרם המחוברת למזרק ובדקו שאין בועת אוויר כלואה בקצה. מקמו את מעמד מחזיק האלקטרודות כך שהקצה הפתוח של הנימים המלאים ב-HBSS יהיה במגע עדין עם הקרנית.
10. השתמש באמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע החדרת בועות אוויר על ידי החזקת מתקן ג'ל העיניים סיכה הפוך והשלכת הטיפות הראשוניות. יש להניח טיפה של ג'ל עיניים סיכה על כל עין כדי לשמור על מוליכות ולמנוע התייבשות במהלך ההקלטה.

2. הקלטת DC-ERG

1. לחץ על צעד (חץ קדימה) כדי לבחור שלב 4/6 "פלאש ארוך No-Li".
2. לחץ על עכבה. השתמש במסך בדיקת עכבה כדי לבחון את ההתנגדות של העיניים השמאלית והימנית. ערכי העכבה של אלקטרודות ההקלטה בכל עין צפויים להיות דומים (~39 kΩ). ערכי העכבה של הקרקע ואלקטרודות הייחוס צפויים להיות פחות מ-10 kΩ).
3. לחץ על תצוגה מקדימה כדי להציג את העקבות עבור העין השמאלית והימנית. המתן להשגת קו בסיס יציב (<10 דקות). לחץ על עצור כדי לצאת מהתצוגה המקדימה של המעקב.
   הערה: שינויים פתאומיים בכיוון הסחף או רעש חריג בהקלטה לא ישתפרו עם הזמן ויחייבו זיהוי האלקטרודה הנימית הדורשת התייחסות. הסיבה הסבירה ביותר היא בועה שהוחדרה לקצה האלקטרודה. מלאו את הטיפ ב-HBSS. לחץ שוב על תצוגה מקדימה כדי לבדוק את תוכנית הבסיס.
4. לחץ על צעד (חץ קדימה) כדי לבחור שלב 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min." נקישה הפעל כדי להתחיל את ההקלטה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Ag/AgCl (פה) אלקטרודה	WPI Inc	EP1	אלקטרודת ייחוס לפה לעכבר
אריחי קרמיקה	סאטר אינסטרומנט	CTS	משמש לחיתוך צינור נימי הזכוכית לגודל מתאים
מקל ניקוי עם קצוות כותנה	מוצרים רפואיים פוריטנים	867-WC ללא דבק	לשמש כספייסר לשיפור ההתאמה של מכלול מחזיק האלקטרודות
מערכת אלקטרורטינוגרמה (ERG)	Diagnosys LLC	מערכת E3	מערכת אלקטרופיזיולוגיה חזותית לאבחון מצבים אופתלמיים במחקר ראייה וניסויים תרופתיים
מבער בונזן	ארגוס טכנולוגיות	BW20002460	או שווה ערך לצורת זכוכית תחת להבה
צינור נימי זכוכית (1.5 מ"מ)	סאטר אינסטרומנטס	BF150-75	למילוי HBSS ויצירת מגע עם הקרנית
תמיסת מלח חוצצת של האנק (HBSS)	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ	14175-095	זמין מסחרית. שמור ב- RT
מסנן מובנה	מה איש	6722-5001	כדי להגן על משאבת ואקום מפני אירוסולים
כבל רעש נמוך למחזיקי מיקרואלקטרודות	WPI Inc	5372	מוצע לשיפור אורך ומיקום הכבלים ומכלולי מחזיקי האלקטרודות
מפרק כדור מגנטי	WPI Inc	500871	למיקום מגנטי של מכלול מחזיק האלקטרודות על הבמה
MatLab	עבודות מתמטיות		MatLab: לעריכת תוכנת הניתוח
ארגז הכלים של Matlab Curvefit	עבודות מתמטיות		ארגז כלים עבור MatLab (נדרש רק לעריכת תוכנת הניתוח)
מהדר MatLab	עבודות מתמטיות		ארגז כלים עבור MatLab (נדרש רק לעריכה ושחרור מחדש של תוכנת הניתוח)
MatLab Runtime גרסה 9.5	עבודות מתמטיות	₪518b (9.5)	נדרש להפעלת תוכנת הניתוח: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
מחזיקי מיקרואלקטרודות (45 מעלות)	WPI Inc	MEH345-15	להחזקת הנימים
מחט (25 ga)	קובידיאן	8881250313	למילוי צינורות נימים עם HBSS
אלקטרודת מחט (הארקה)	רית'מלינק	13 מ"מ - אלקטרוד אחד	אלקטרודת מחט תת-עורית (הארקה) לעכבר (אורך 13 מ"מ, מחט בקוטר 0.4 מ"מ, חוט מוליך 1.5 מטר)
רגולטור/מזגן חשמל	פורמן	P-1800	או שווה ערך להסרת היסט DC מהרעש המוחדר דרך קו החשמל
מזרק (12 מ"ל)	מונוג'קט	1181200777	למילוי צינורות נימים עם HBSS
טי-קליפ	קול-פרמר	06852-20	להרכבת מחזיק אלקטרודות
מייבש ואקום	בל-ארט	420120000	תחתית וכיסוי פוליקרבונט שקופים
טיפול תרופתי
ג'ל עיניים סיכה	אלקון	0078-0429-47	מסייע בשימון פני הקרנית ובשמירה על מגע חשמלי עם אלקטרודות נימיות
פנילפרין הידרוכלוריד 2.5%	אקורן	17478-201-15	טיפות עיניים מידריאטיות קצרות פעולה (להרחבת אישונים)
פרופרקאין הידרוכלוריד 0.5%	אקורן	17478-263-12	הרדמה מקומית להחדרה אופתלמית
טרופיקמיד 0.5%	אקורן	17478-101-12	טיפות עיניים מידריאטיות קצרות פעולה (להרחבת אישונים)
קסילזין	אנסד	sc-362949Rx	משכך כאבים ומרפה שרירים
זטמין (קטמין הידרוכלוריד)	VetOne	501072	חומר הרדמה להזרקות תוך שריריות