הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של Drosophila Sensilla בתגובה לריחות נדיפים

תקציר

מקור: Ng, R., et al. הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ- Drosophila Trichoid sensilla בתגובה לריחות בעלי תנודתיות נמוכה. J. Vis. Exp. (2017).

בסרטון זה, זבוב דרוזופילה חי מותקן בצינור למחקרים אלקטרופיזיולוגיים. אלקטרודות ממוקמות בבסיס הסנסילום כדי לרשום תגובות עצביות ספציפיות לפרומונים עם נוירוני קולטן הריח של הזבוב.

פרוטוקול

1. הכנת החומרה להקלטת at4

1. השתמש במכשיר מושך פיפטה להכנת אלקטרודות עם נימי זכוכית אלומיניום (O.D 1.0 מ"מ, ת.ז. 0.64 מ"מ). הקהו מעט את קצה אלקטרודת הייחוס בעזרת זוג מלקחיים עדינים כדי להקל על החדרתם לקליפאוס של הזבוב (כלומר צלחת מעוגלת בקדמת ראש הזבוב, מעל חלקי הפה).
   הערה: במחקר זה נעשה שימוש בזכרי WT (סוג פראי) בני 7 ימים (ברלין). השתמש בתמיסת מלח AHL כאלקטרוליט עבור שתי האלקטרודות.
2. להכין 1 ליטר של AHL (דמוי המולימפה למבוגרים) על ידי ערבוב 900 מ"ל של מים מזוקקים עם 6.312 גרם של NaCl, 0.373 גרם של KCl, 0.337 גרם של NaHCO₃, 0.1120 גרם של NaH₂PO₄, 1.892 גרם של Trehalose_{ּ2H 2}O, 3.423 גרם של סוכרוז, 1.192 גרם של HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic חומצה), ו 8.2 מ"ל של 1M MgCl₂. באמצעות מים מזוקקים, להביא את הנפח הכולל עד 1 L. להביא את ה- pH ל 7.4 באמצעות 1 N NaOH ולעקר את התמיסה עם מערכת מסנן מונע ואקום. לאחסון לטווח ארוך, שמור את AHL aliquots על 4 ° C.
   הערה: אספקה עקבית של חומצה פלמיטולאית מותנית באחידות בין המחסניות. יש להרכיב כל מחסנית באופן הניתן לשחזור.
3. באמצעות סכין גילוח, הסר 0.9 ס"מ מקצה קצה פיפטה של 200 μL כדי ליצור את חלק המחסנית הראשון, בגודל 4.1 ס"מ; עיין במידות המפורטות באיור 1A. השתמש בקצה פיפטה נוסף של 200 μL והסר 1.7 ס"מ ו- 1.5 ס"מ מהקצה ומהבסיס כדי ליצור את חלק המחסנית השני, מידותיו 1.8 ס"מ (איור 1A). השתמש בסרגל כדי להבטיח יכולת שחזור.
4. השתמש בניקוב חורים בגודל 1/8 אינץ' כדי לחתוך דיסקים מנייר סינון.
5. השתמש במלקחיים כדי למקם דיסק נייר סינון בקצה מקטע המחסנית השני. אשר חזותית פתח בקצה המחסנית שדרכו האוויר יכול לעבור.
6. חברו את מקטע המחסנית הראשון והשני, כפי שמוצג באיור 1A. הפנו את מקטע המחסנית השני כלפי מטה כדי להקל על כיוון ריבועי ההכנה (איור 1B).
7. חבר את המחסנית עם צינור העברת הריח המותקן על micromanipulator.
   הערה: עיצוב זה מאפשר לסובב את המחסנית כלפי חוץ כדי להקל על ההחלפה (איור 1C).
8. הגדר את זרימת האוויר הלח הקבועה ל- 2 ליטר לדקה בבקר מסה אחד ואת זרימת הריח ל- 500 מ"ל לדקה בבקר מסה אחר.
9. באמצעות התוכנה (ראה טבלת החומרים), תכנת את ההליך למתן נשיפה ריחנית של 500 אלפיות השנייה.

2. הכנת תמיסות ריח חומצה פלמיטולאית למשלוח

הערה: ORNs Or47b מגיבים הן לחומצה cis- והן לחומצה טרנס-פלמיטולאית. מכיוון שחומצה פלמיטולאית אינה יציבה ב- RT, המלאי מאוחסן ב -20 ° C ומשמש תוך חודש עם הפתיחה. אתנול הוא הממס המועדף על חומצה פלמיטולאית.

1. השתמש במערבול מערבולת כדי לערבב ביסודיות 10 μL של ציר חומצה cis- או trans-palmitoleic או דילולים עם 90 μL של 100% אתנול עבור דילולים סדרתיים פי עשרה במיקרו-צינוריות של 1.7 מ"ל. הכינו דילולי חומצה פלמיטולאית טריים מדי יום לפני ניסויים והשתמשו תוך יום.
   הערה: בקבוקון זכוכית מומלץ לריחות שאינם מסיסים באתנול להכנת דילולי ריח עם סוגים אחרים של ממיסים אורגניים.
2. באמצעות מיקרופיפטה P10, החל 5 μL של תמיסות חומצה cis-palmitoleic של דילולים הרצויים על נייר המסנן בכל מחסנית מתאימה.
   הערה: המינון הגבוה ביותר (^10-1) מכיל 450 מיקרוגרם של התרכובת. עבור תמיסות חומצה trans-palmitoleic, להחיל 4.5 μL במקום, כך המינון הגבוה ביותר (^10-1) מכיל 450 מיקרוגרם של התרכובת.
3. הניחו את מחסניות החומצה הפלמיטולאית במייבש ואקום למשך שעה אחת ב-RT ובלחץ של 7.59 מ"מ כספית כדי לאדות לחלוטין את הממס.
   הערה: ניתן להשתמש במחסניות למשך עד 4 שעות ב-RT.

3. הכנת דרוזופילה לגישה מוכנה ל-at4 Sensilla עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות In Vivo

הערה: זבובי WT (ברלין) גדלים בתווך קמח תירס סטנדרטי ב-25 מעלות צלזיוס במחזור בהיר-כהה של 12:12. עם האקלוסיה, הזבובים מופרדים על ידי המין לקבוצות של עשרה, כאשר הם שוכנים בקבוצה עד גיל 7 ד'. ORNs Or47b (נוירונים קולטני ריח) בזבובים זכרים ונקבות כאחד מגיבים לחומצה פלמיטולאית. לשם הפשטות, רק זבובים זכרים נבדקים במחקר הנוכחי.

1. הרכיבו שקופית הכנה לזבוב: על מגלשת זכוכית, הניחו כיסוי זכוכית (18 x 18 מ"מ2) על כמות קטנה של חימר דוגמנות, ויצרו זווית ~ 3° עם מגלשת הזכוכית. הניחו סרט דו-צדדי על הקצה הפנימי של הכיסוי ועל אזור השקופית שמתחתיו. החלף בסרט חדש עבור כל יום של הקלטה (איור 2A).
2. השתמש בשואף זבוב15 כדי לאסוף את הזבוב המעניין בצינור ולאחר מכן הכנס קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר על קצה הצינור. במקביל, העבירו את הצינור קדימה תוך כדי נשיפת אוויר לתוכו כדי לדחוף את הזבוב לקצה קצה הפיפטה. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך ממש מתחת לגוף הזבוב ובאורכים של 2 ראשים מעל הזבוב.
3. הדקו את החלק התחתון של קצה הפיפטה בעזרת חימר מידול, ודחפו את הזבוב כלפי מעלה עד שגם האנטנות וגם הקליפאוס נחשפים (איור 2B). כדי להימנע מהרג הזבוב, הוסיפו רק מספיק חימר כדי לחשוף את האנטנות ואת האריסטה, מכיוון שזה מונע את ריסוק בטנו של הזבוב. יתר על כן, מוסיפים חימר לאט ובעדינות כדי למנוע התכווצות פתאומית. ודא שהזבוב חי על ידי בדיקת תנועת אנטנה או חוטם.
4. השתמש במלקחיים כדי לתמרן את קצה פיפטה המאכלס את הזבוב. כיוון את הראש כך שהקליפוס יפנה לימינו של הצופה. כוונן את ההכנה לאורך הכיסוי באמצעות מלקחיים עדינים עד שהצד הצדדי של האנטנה מונח כנגד משטח הכיסוי המודבק (איור 2B).
5. הניחו מוט אחיזה על האריסטה כדי לאבטח את האנטנה לסרט הדו-צדדי כדי למנוע תזוזה (איור 2B).
   הערה: מוט האחיזה נמשך מנימי זכוכית בורוסיליקט עם מושך פיפטה ומוחזק במקומו עם חימר מידול (איור 2A).
6. הניחו את ההכנה על במת האסדה (איור 2C). באמצעות המיקרוסקופ, ודא כי הטריכואיד נראה לאורך הקצה הדיסטלי-צדדי של המקטע השלישי של האנטנה.
   הערה: הסנסילה צריכה להיות צללית על הרקע, לפשט את זיהויים ולהקל על ההקלטה (איור 3). בהכנה זו, הסנסילה הטריכואידית הנגישה ביותר היא מסוג at4.
7. כפי שתואר קודם לכן, 2, 15, שומרים על ההכנה תחת זרימת אוויר לחה קבועה (2 ליטר/דקה) המועברת דרך צינור העברת אוויר נפרד במרחק של כ-2 ס"מ מההכנה (איור 4).

4. הקלטה של פעילות at4 Sensillum מ-ORN Or47b בטריכואידים at4 בתגובה לחומצה פלמיטולאית

1. הכניסו את אלקטרודת הייחוס לקליפאוס (איור 3A). בתנועה מהירה וחלקה, ודא שהאלקטרודה מוחדרת ממש מתחת לפני השטח, שם היא יכולה ליצור קשר עם המולימפה מתחת לקוטיקולה כדי למנוע נזק לרקמות.
2. הנמיכו את אלקטרודת ההקלטה באיטיות עד שהיא תיכנס לאותו מישור ראייה כמו סנסילום המטרה (איור 3B). הקלט תחת עדשה אובייקטיבית 50X.
   הערה: הקוטיקולה הטריכואידלית הקשוחה מחייבת החדרת אלקטרודת ההקלטה לבסיס הרגיש, ששטחו הרחב יותר מספק מטרה גדולה יותר המפחיתה את הסבירות שהאלקטרודה תוסט (איור 3B, כניסה).
3. לפני החלת גירויי ריח על סנסילום, יש להקפיד על קריטריוני הבחירה הבאים: יש לדחות כל טריכואיד שאינו עומד בסטנדרטים אלה, ובמקומו לבחור סנסילום אחר.
   1. שימו לב ליחס אות לרעש גבוה (ראו איור 3C לדוגמה).
   2. שימו לב לקוצים הניתנים לזיהוי מתאי עצב at4A ו-at4C (איור 3C).
      הערה: משרעת הספייק at4B נראית דומה מאוד ל-at4A10 ולא ניתן לזהות אותה בקלות ללא גירוי ריח.
   3. שימו לב שקצב הירי הבסיסי של תאי העצב at4A הוא סביב או מתחת ל-20 הרץ.
      הערה: קריטריון זה הוא ספציפי עבור at4A מכיוון שקצב הירי הבסיסי של תא העצב גבוה מזה של ORN הבסיס. ירי בסיסי גבוה בהרבה מצביע על כך שייתכן שהנוירונים נפגעו במהלך החדרת האלקטרודות.
4. חבר את המחסנית לצינור העברת הריח. התחילו עם הדברת הממסים ולאחר מכן עם הריחות, מריכוזים נמוכים לגבוהים. השתמש במיקרומניפולטור כדי לתמרן את המחסנית לכיוון ההכנה תוך כיוון המחסנית ישר לראש ההכנה. ודא חזותית שהמחסנית מכוונת ישירות אל האנטנה (איור 4) ממרחק של כמה מילימטרים.
   הערה: המטרה היא לכוון את פתח המחסנית ישירות אל האנטנה ולמקם אותה בסמוך לרקמת המטרה.
5. ודא שמחסנית הריח מופרדת מאלקטרודת ההקלטה מימין ב- 1 - 2 מ"מ וממגלשת הכנת הזבוב למטה בכ- 1 מ"מ.
   הערה: בהתקנה המתוארת כאן, מחסנית הריח תחומה באופן הדוק על-ידי אלקטרודת ההקלטה, אלקטרודת הייחוס ושקופית הכנת הזבוב (איור 4).
   הערה: שקול את המרחק בין המחסנית לבין אלקטרודות ההקלטה/הייחוס. מומלץ מרחק של כ-4 מ"מ. מגע לא מכוון עלול להפסיק את האות ולשבור את קצה אלקטרודת ההקלטה, לפגוע בתא העצב הנוכחי ולסבך הקלטות נוספות.
   הערה: שקול את המרחק המפריד בין המחסנית לבין שקופית הכנת הזבוב. נגיעה בתלוש הכיסוי עלולה גם לעקור את אלקטרודת ההקלטה ולשבש את ההקלטה.
6. לחץ על "הקלט" בתוכנת רכישת הנתונים כדי להתחיל בהקלטה.
   הערה: עבור כל הקלטה של 10 שניות, פולס ריח יחיד של 500 אלפיות השנייה מועבר ישירות לאנטנה, כמתואר בשלב 1.9.
7. לאחר מריחת הריח, שלפו בזהירות את המחסנית לפני החלפתה במחסנית בעלת הריכוז הגבוה ביותר. יש להמשיך עד לקבלת טווח המינונים המלא.
   הערה: מומלץ להקליט רק ORN Or47b אחד מכל זבוב כדי למנוע השפעות אפשריות של הסתגלות.
8. שטפו היטב את אלקטרודת ההקלטה במים מזוקקים לאחר סיום ההקלטה ליום.
9. נתח והתווה את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח לא מקוונת הזמינה מסחרית.

תוצאות

איור 1: הגדרת מחסנית ואולפקטומטר. (א) הכנת מחסניות ריח. משמאל לימין: קצה פיפטה סטנדרטי של 200 מיקרוליטר, חלקי המחסנית הראשונה והשנייה, ומחסנית ריח שלמה. (B) המחסנית המחוברת לאולפקטומטר, המראה את הזווית כלפי מטה של החלק השני. (C) מערך אולפקטומטר המתאר את צינור העברת הריח המותקן על המיקרומניפולטור, עם מחסנית ריח מחוברת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערך הכנה וחומרים שונים
מכשיר פיפטה פולר	סאטר אינסטרומנטס, נובאטו, קליפורניה, ארה"ב	עמ' 97	פיפטה פולר
נימי זכוכית בורוסיליקט	World Precision Instruments, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	1B100F-4	להכנת מוטות אחיזה
נימי זכוכית אלומינוסיליקט	סאטר אינסטרומנטס, נובאטו, קליפורניה, ארה"ב	AF100-64-10	כדי ליצור אלקטרודות
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost	Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב	12-550-143	עבור תחנת הכנה לטיסה
סרט דו-צדדי קבוע	Scotch St. Paul, MN, ארה"ב	נה	עבור תחנת הכנה לטיסה
מיקרוסקופ זקוף	Olympus , שינג'וקו טוקיו יפן	BX51	עבור מתקן הקלטה
פלסטלינה, דוגמנות חימר	ואן אקן, צפון צ'רלסטון, דרום קרוליינה, ארה"ב (ארצות הברית)	B0019QZMQQ	לעמדת הכנה ולייצוב מוט האחיזה
יחידת סינון סטרילית חד פעמית עם זרימה מהירה עם קרום SFCA, 0.45 מ"מ	Nalgene , רוצ'סטר ניו יורק ארה"ב	#156-4045	כדי לעקר את פתרון AHL
200 μL קצה פיפטה	VWR Radnor, פנסילבניה, ארה"ב	53508-810	כדי ליצור מחסניות ריח ולהכין זבובים
נייר סינון	Whatman , מיידסטון, קנט UK	740-E	כדי ליצור מחסניות ריח
מייבש ואקום	קול-פרמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב	VX-06514-30	לאידוי ממס אתנול
חומצה CIS-palmitoleic	Cayman Chemical, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b odorant
חומצה טרנס-פלמיטולאית	Cayman Chemical, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b odorant
אתנול	ספקטרום כימי MFG. ניו ברונסוויק, ניו ג'רזי, ארה"ב	E1028-500MLGL	לדלל חומצה פלמיטולאית
מיקרומניפולטור מחסנית ריח	Siskiyou, Grants Pass או ארה"ב	MX130R	כדי למקם את האולפקטומטר
תוכנת Flow Vision	Alicat , טוסקון אריזונה ארה"ב	FLOWVISIONSC	תוכנה לשליטה בקצב הזרימה
בקר מסה	Alicat , טוסקון אריזונה ארה"ב	MC-2SLPM-D	כדי לשלוט בקצב הזרימה של אוויר לח
בקר מסה	Alicat , טוסקון אריזונה ארה"ב	MC-500SCCM-D	כדי לשלוט בקצב הזרימה של גירוי ריח
קלמפקס	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב	גרסה 10.4	תוכנה לרכישת נתונים
צינור משלוח אוויר	אייס גלאס, ויינלנד ניו ג'רזי ארה"ב	8802-936	כדי לספק אוויר לח
עדשה אובייקטיבית 50X	Olympus , שינג'וקו טוקיו יפן	LMPLFL50X	מתקן הקלטה
קלמפיט 10	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב	גרסה 10.4	תוכנה לניתוח ספייק
איגור 6 Pro	WaveMetrics, לייק אוסווגו או ארה"ב (ארה"ב)	גרסה 6.37	תוכנה לניתוח נתונים
צג שמע	ALA Scientific Instruments, פרמינגדייל, ניו יורק, ארה"ב	NPIEXB-AUDIS-08B	Aurally מדווחת על עליות בודדות
מגבר חוץ-תאי	ALA Scientific Instruments, פרמינגדייל, ניו יורק, ארה"ב	NPIEXT-02F	כדי להגדיל את המשרעת של אותות חשמליים
בקר שסתום	וורנר אינסטרומנטס	VC-8	כדי לשלוט על פתיחת השסתום לגירוי ריח
הקלטת מיקרומניפולטור אלקטרודות	סאטר אינסטרומנטס, נובאטו, קליפורניה, ארה"ב	MP-285	כדי למקם אלקטרודת הקלטה
מגבר Headstage	ALA Scientific Instruments, פרמינגדייל, ניו יורק, ארה"ב	EQ-16.0008	כדי להגדיל את המשרעת של אותות חשמליים
אוסצילוסקופ	Tektronix, ביברטון או ארה"ב	TDS2000C	דו"ח חזותי של קוצים בודדים