גירוי שורש עצב שמיעתי והקלטות זרם פוסט-סינפטי בפרוסת טריז במוח עכבר

Abstract

מקור: Fischl, M. J., et al. In Vitro Wedge Slice Preparation for mimiking in vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp.(2020)

סרטון זה מדגים פרוטוקול לגירוי שורש עצב השמיעה ולרישום זרמים פוסט-סינפטיים בנוירונים אוליבוקוכלריים מדיאליים בפרוסות טריז במוח עכבר.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הגדרה והקלטה של אלקטרופיזיולוגיה

1. מניחים את פרוסת הטריז בתא ההקלטה ומהדקים את הפרוסה בעזרת נבל או מערכת ייצוב. יש לנקב את הרקמה ברציפות בקצב של 7-10 מ"ל/דקה עם ACSF חם (35°C) מבעבע בקרבוגן.
2. זהה נוירונים MOC אוליבוקוכלריים מדיאליים מסומנים גנטית בגרעין הגחון של גוף הטרפז VNTB באמצעות אפיפלואורסנציה עם מסנני פליטה של 561 ננומטר לרישומי מהדק טלאי. הפוך פרוסה אם אין תאים הניתנים לתיקון.
3. באמצעות אופטיקת DIC, התמקדו בשורש עצב השמיעה בצד העבה של הפרוסה והשתמשו במיקרומניפולטור כדי להעביר את האלקטרודה המגרה טונגסטן דו קוטבי למטה אל שורש עצב השמיעה ובעדינות אל פני השטח של הרקמה.
   הערה: אלקטרודות יניקה שימשו בניסויים לגירוי עצבי שמיעה במעבדות אחרות. ניתן להשתמש באלקטרודות זכוכית תטא או בשיטות גירוי אופטי אם רלוונטי לתכשירים ספציפיים אחרים.
4. הזז את שדה הראייה בחזרה ל- VNTB כדי לבחור נוירון MOC לכוון לאלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי.
5. מלאו פיפטת הקלטה בפתרון פנימי מתאים לניסוי המוצע.
6. תקן והקלט מתא העצב MOC בתצורת התא כולו. פיצוי על קיבוליות הממברנה והתנגדות הסדרה במידת הצורך.
7. התאם את משרעת הגירוי החשמלי של שורש עצב השמיעה כדי לקבל אירועים פוסט-סינפטיים עקביים בנוירון MOC.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להזיז את אלקטרודת הגירוי.
8. הפעל פרוטוקולי גירוי מתאימים כדי לצפות בזרמים סינפטיים מעוררים ב- MOC (מהדק מתח).
   הערה: ניתן להשתמש בהכנת פרוסת הטריז עם כל כלי מהדק טלאי טיפוסי כגון הקלטות טלאי רופפות, פרמקולוגיה, אופטוגנטיקה, הדמיית סידן, ניקור נוירוטרנסמיטר וכו '.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף A1R	Nikon Instruments		אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופ הדמיה, יכול להיות כל מיקרוסקופ תואם אלקטרופיזיולוגיה
אלקטרודה זכוכית בורוסיליקט עם נימה OD 1.5 מ"מ, מזהה 1.1 מ"מ, אורך 10 ס"מ	סאטר אינסטרומנט	BF150-110-10	זכוכית פיפטה מהדקת טלאי
מילוי אלקטרודות MicroFil	WPI	CMF20G	מילוי פיפטה אלקטרודת טלאי
מחמם פתרון מובנה	וורנר אינסטרומנטס (GSAdvantage)	SH-27B	מחמם מערכת זילוח פרוסה
מערכות מולטי-מיקרומניפולטור	חדירות סאטר	MPC-200 עם MP285	מיקרומניפולטורים למהדק טלאי ומיקום אלקטרודות גירוי
P-1000 מושך פיפטה אופקי עבור מיקרופיפטות זכוכית	כלי נגינה של סאטר	FG-P1000	Patch מהדק pipetter puller
מגבר מהדק תיקון ותוכנה	הקה	EPC-10 / Patchmaster הבא	יכול להיות כל מגבר/תוכנה
תא הקלטה	וורנר אינסטרומנטס	RC26G	פורסים "אמבטיה" במהלך ההקלטה
נבל קאמרי הקלטה	וורנר אינסטרומנטס	640253	מייצב פרוסה במהלך הקלטה אלקטרופיזיולוגית
תא דגירה פרוס	בנייה מותאמת אישית		תא אחיזה מחומם ומחומצן לפרוסות במהלך ההתאוששות לאחר החיתוך
יחידת בידוד גירויים	א.מ.פ.י.	איזו-פלקס	יחידת בידוד גירוי לאלקטרופיזיולוגיה
מזרק 60CC	פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים)	14-820-11	אלקטרופיזיולוגיה טיפול בנוזל זילוח
בקר טמפרטורה	וורנר אינסטרומנטס (GSAdvantage)	TC-324C	בקר טמפרטורה של מערכת זילוח פרוסות
אבובים 1/8 OD 1/16 ID	פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים)	14-171-129	אלקטרופיזיולוגיה טיפול בנוזל זילוח
Tugsten מיקרואלקטרודה דו קוטבית קונצנטרית	WPI	TM33CCINS	אלקטרודה מגרה לאלקטרופיזיולוגיה