הקלטת תגובות סינפטיות CA3-CA1 בפרוסה היפוקמפוסית של חולדה

תקציר

מקור: Shetty, M. S. et al., Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from מכרסמים.J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים שיטה לתיעוד תגובות סינפטיות CA3-CA1 בפרוסת היפוקמפוס של חולדה. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהצבת אלקטרודות הגירוי וההקלטה על פרוסת ההיפוקמפוס ובמדידת הפוטנציאל הפוסט-סינפטי מעורר השדה (fEPSP) כדי להעריך את עוצמת התגובה הסינפטית.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הקלטה של תגובות סינפטיות CA3-CA1

הערה: מערך האלקטרופיזיולוגיה המשמש לרישום פוטנציאלי שדה מוצג באיור 1A. כלוב פאראדיי מומלץ בחום אם ההפרעה החשמלית אינה בשליטתה לאחר הארקה נכונה של ההגדרות החשמליות. סוגים רבים ושונים של תאים שקועים ותאי ממשק זמינים באופן מסחרי. עם זאת, תאי ממשק מועדפים מכיוון שפרוסות מציגות בהן תגובות סינפטיות חזקות יותר.

1. מיקום אלקטרודות
   1. הפעל את המנגנון החשמלי (ממריצים ומגברים) לשימוש. הרכיבו ואבטחו את אלקטרודות הגירוי וההקלטה במחזיקי הפרספקס של המיקרומניפולטורים.
      הערה: אנו משתמשים באלקטרודות מונופולריות, מצופות לכה, נירוסטה בעלות התנגדות של 5 MΩ הן למטרות גירוי והן למטרות הקלטה.
   2. לפני השימוש, הכניסו את האלקטרודות האלה לתוך נימי הזכוכית שנמשכו והדקו באמצעות דבק אפוקסי, תוך חשיפת חלק קטן בלבד מקצה האלקטרודה (איור 1E). זה נותן כוח לאלקטרודות הדקות אחרת ועוזר לאבטח אותן היטב במחזיקי האלקטרודות.
   3. מונחה תחת המיקרוסקופ, מקם את האלקטרודות המעוררות בשכבת רדיאטום של אזור CA1 כדי לעורר את סיבי Schaffer collateral ואת אלקטרודת הרישום באזור הדנדריטי האפי של CA1 כדי להקליט תגובות שדה EPSP (fEPSP).
      הערה: התקרבות למשטח הנוזלי שמעל הפרוסה עם האלקטרודות נותנת צליל המסייע לאתר את פני השטח של הפרוסה במהירות (בתנאי שהמגבר מחובר לרמקול).
   4. בניסויי תיוג ולכידה סינפטיים, בהתאם לצורך הניסוי, מקם שתיים או שלוש אלקטרודות מעוררות (S1, S2 או S3) משני צדי אלקטרודת ההקלטה כדי לעורר שתיים או יותר קלטים עצמאיים אך חופפים. מקמו את האלקטרודות המעוררות והמקליטות במרחק של כ-200 מיקרומטר זו מזו.
   5. במידת הצורך, אתרו אלקטרודת הקלטה נוספת בשכבת הפירמידלה לרישום גידול באוכלוסייה (איור 2A). כאשר שתי האלקטרודות נגעו בפרוסה, באמצעות תוכנת הרכישה, תן גירוי בדיקה כדי להבטיח אות fEPSP תקין.
      הערה: אנו משתמשים בפולסים דו-פאזיים, זרם קבוע (משך דחף 0.1 מילישנייה/חצי גל) לגירוי בדיקה.
   6. לאחר קבלת אות fEPSP תקין, בזהירות להוריד את האלקטרודות על 200 מיקרומטר עמוק באמצעות ידיות תנועה עדינות של מניפולטורים. המתינו 20 דקות עד שהפרוסות יתאוששו.
2. יחסי קלט-פלט
   1. קבע את יחס הקלט-פלט (גירוי afferent לעומת שיפוע fEPSP) עבור כל קלט על-ידי מדידת ערך השיפוע בטווח של עוצמות זרם. בצעו זאת בין 20 μA ל-100 μA. לאחר מכן הגדר את עוצמת הגירוי עבור כל קלט כדי להשיג 40% מהשיפוע המרבי של fEPSP. שמור על זה קבוע לאורך כל הניסוי.
   2. לאחר 15-20 דקות, התחל להקליט את קו הבסיס. עקוב מקרוב אחר שיפוע fEPSP במהלך תקופה זו ואפס את עוצמת הגירוי אם השיפוע משתנה ביותר מ- 10% מהערך שנקבע והתחל קו בסיס חדש. הקלט לפחות 30 דקות או קו בסיס יציב של שעה לפני שתמשיך.
      הערה: עבור הבדיקה או הגירוי הבסיסי, אנו משתמשים בארבעה טאטוא של 0.2 הרץ דו-פאזי, פולסי זרם קבוע (0.1 msec לכל קוטביות) הניתנים כל 5 דקות. שיפוע ממוצע של ארבע תגובות אלה נחשב לאחר מכן כחזרה אחת. האותות מסוננים ומוגברים על ידי מגבר דיפרנציאלי, עוברים דיגיטציה באמצעות ממיר אנלוגי-לדיגיטלי ומנוטרים באופן מקוון באמצעות תוכנה מותאמת אישית.

תוצאות

איור 1.מערך אלקטרופיזיולוגי להקלטות בעלות פוטנציאל שדה המורכב מ- (A) ממריצים, (ב) מגבר דיפרנציאלי (c) ממיר אנלוגי-לדיגיטלי, (d) מחשב אוסצילוסקופ (e) עם תוכנת רכישה, (f) מיקרוסקופ שולחני עמיד בפני רעידות (g) עם הגדלה של >4x (h), ממשק תא פרוסת מוח (i) מערכת זילוח עבור ACSF ואספקת קרבוגן (j), בקר טמפרטורה (k) מקור תאורה (l) מניפולטורים עם מחזיקי אלקטרודות. (B) תא פרו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
I. כימיקלים של רכיבי ACSF
1. נתרן כלורי (NaCl)	סיגמא-אולדריץ'	S5886
2. אשלגן כלורי (KCl)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9541
3. מגנזיום סולפט heptahydrate (MgSO4.7H20)	סיגמא-אולדריץ'	M1880
4. סידן כלורי דיהידרט (CaCl2.2H2O)	סיגמא-אולדריץ'	C3881
5. אשלגן פוספט monobasic (KH2PO4)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9791
6. סודיום ביקרבונט (NaHCO3)	סיגמא-אולדריץ'	S5761
7. D-גלוקוז נטול מים (C6H12O6)	סיגמא-אולדריץ'	G7021
II. מכשירים אלקטרופיזיולוגיים
1. מיקרוסקופ	אולימפוס, יפן	דגם SZ61
2. בקר טמפרטורה	עיצוב מערכות מדעיות בע"מ קנדה	PTC03
3. מגבר AC דיפרנציאלי	AM Systems, ארצות הברית	דגם 1700
4. ממריץ דופק מבודד	AM Systems, ארצות הברית	דגם 2100
5. אוסצילוסקופ	רוד אנד שוורץ	HM0722
6. ממיר דיגיטלי-אנלוגי	קיימברידג' עיצוב אלקטרוני בע"מ קיימברידג', בריטניה	CED-הספק 1401-3
7. תא פרוסת מוח ממשק	עיצוב מערכות מדעיות בע"מ קנדה	BSC01
8. משאבת צינורות	Ismatec, Idex Health & Science, גרמניה	REGLO-אנלוגי
9. מד זרימה קרבוגן	קול-פרמר	03220-44
10. מאיר אור סיבים	דולן-ג'נר תעשיות	Fiber Lite MI-150
11. מיקרומניפולטורים	Marzhauser Wetzlar, גרמניה	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)
12. אלקטרודות	AM Systems, ארצות הברית	571000 (פלדת אל-חלד; 0.010, 5MΩ, 8 מעלות)