זיהוי תגובות פיזיולוגיות מתאי עצב חושיים בדרוזופילה

1. הכנת דוגמאות

1. חצו את קו הנהג Gal4 לזבובי UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). אפשר לצלב לגדול ב 25 ° C.
   הערה: יצירת זבובים עם עותקים מרובים של טרנסגנים Gal4 או UAS-GCaMP יכולה לעזור לשפר את עוצמת האות הפלואורסצנטי. גרסה מוקדמת יותר של טרנסגן UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) הראתה עוצמת פלואורסצנטיות חלשה מאוד כאשר באה לידי ביטוי תחת שליטתו של מנהל ההתקן Gr68a-Gal4.
   1. לאסוף ולהפריד לפי מין זבובים בוגרים שזה עתה נסגרו ולגדל ב 25 ° C.
      הערה: הרמה הבסיסית של פלואורסצנטיות GCaMP5G היא אופטימלית בזבובים בגילאי 14 עד 28 ימים. בידוד זבובים על ידי מין מונע את האפשרות של אינטראקציות חברתיות שעשויות להשפיע על התגובות העצביות.
2. מרדימים זבוב תחת זרם מתון של CO₂.
3. חברו את הזבוב לכיסוי זכוכית על ידי הנחת טיפה קטנה של לק במרכז כיסוי בקוטר 0.17 מ"מ. הניחו בעדינות זבוב על צידו על טיפת לק שקופה וודאו שהזבוב מכסה את כל הטיפה.
4. בצע שלבים 1.5 ו-1.6 תחת מיקרוסקופ מנתח המשמש בהגדלה פי 8.
5. השתמשו במברשת צבע רטובה כדי להאריך את הרגל הקדמית של הזבוב. אבטחו את הרגל הקדמית במקומה על-ידי הנחת שתי רצועות דקות של נייר דבק מעל המקטעים הטרסליים הראשון והחמישי (איור 1A). זה יחשוף מקטעים טרסליים T2-T4 להדמיה (איור 1B).
6. כדי לדמיין תאי עצב על החוטם, הניחו פס דק של סרט הדבקה מעל הרוסטרום של החוטם כדי לחשוף את התווית (איור 1C, D).
7. צייר מחסום הידרופובי סביב הזבוב עם עט PAP (Peroxidase-antiperoxidase) כדי למנוע מהתמיסה לזרום על משטח הכיסוי. יש למדוד תוך 30 דקות מרגע ההרכבה.

2. הכנת פתרון גירוי

1. ליגנדות ליפופיליות מדוללות (כגון CH₅0₃, בהן נעשה שימוש במחקר זה) בתמיסת PBST (מלח חוצץ פוספט עם Triton X-100): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 0.1% Triton X-100 (v/v); pH 7.4.
   1. הכינו תמיסת ציר של 1 מ"ג/מ"ל של הליגנד באמצעות PBST. הכן את כל הדילולים הבאים של פתרון המניות באמצעות PBST.
      הערה: בהתאם למסיסות של ליגנד הריבית, ייתכן שיהיה צורך בממיסים שונים כדי להמיס אותו. טבלה 1 מתארת את המסיסות של CH₅0₃ בממיסים שונים. שלא כמו ממסים אחרים, PBST לא הגדיל פלואורסצנטיות.

3. גירוי של נוירונים ורכישת תמונה

1. באמצעות פיפטור 10 μl, מניחים 10 μl של PBST על המקטעים tarsal.
   הערה: שלב זה מרטיב את הרגל ומונע מהמקטעים הטרסליים להיסחף.
2. השתמש במערכת אופטית בעלת מצלמה במהירות ורגישות מספיקות כדי להשיג אות פלואורסצנטי טוב ברזולוציית זמן גבוהה.
   הערה: במחקר זה השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב ובמצלמת sCMOS (ראו רשימת חומרים).
3. בחר את המקטע הטרסלי הספציפי ואת תאי העצב שיש להדמיה. לרכוש שלוש ערימות Z קונפוקליות טרום גירוי.
   1. באופן אידיאלי, השתמש בהגדרות רכישה מהירות מספיק כדי לאפשר רזולוציית זמן מרבית ועדיין ללכוד את נפח התא כולו. הגדרות רכישה לדוגמה הן: חשיפה של 200 msec, binning מקטעים אופטיים של 2 x 2 ו- 6 x 0.5 μm2, שנלכדו כל 2 שניות
      הערה: רגליים משותקות צולמו בהצלחה במשך עד 10 דקות, במרווחים של 30 שניות, ללא הלבנה ניכרת של אות GCaMP. לזמני הקלטה ארוכים יותר, יש לוודא שהרגליים מוחזקות היטב במקומן על הכיסוי.
   2. מטב את עוצמת הלייזר לקבלת האות לרעש הגבוה ביותר שניתן להשיג עם הלבנה מינימלית במהלך כל משטר ההדמיה. עבור הניסויים המתוארים כאן, השתמש בלייזר דיודה 491 ננומטר (100 mW) בשידור של 30% כדי לצלם נוירונים Gr68a ו- ppk23 על הרגליים ועל פרובוסקיס. השתמש באיגוד 2 x 2 כדי לאפשר זמני חשיפה קצרים יותר ועדיין להשיג רזולוציה מרחבית מספקת.
      הערה: הגדרות עוצמת הלייזר הותאמו כדי לזהות שינויים פלואורסצנטיים הנעים בין פי 1.2 עד פי 4.5.
4. פיפטה 10 μl של תמיסת הגירוי על קטעי tarsal. הוסף עוד 10 μl של PBST עבור ניסויי בקרה. לרכוש מיד 117 תמונות לאחר גירוי.
   הערה: מספר התמונות שנרכשו לאחר הגירוי מבוסס על הזמן שלקח להגיע לשינוי המקסימלי בפלואורסצנטיות (כ-2 דקות).
   1. שלב קריטי: בעת תמיסת פיפטה על התכשיר, אין לגעת בזבוב עם קצה הפיפטה, מכיוון שהדבר יגרום לרגל הקדמית לזוז ממקומה.
      הערה: לחלופין, השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם במדויק נימי זכוכית המכילים גירוי קרוב לקטע הטרסלי שיש לצלם. לספק נפחים מבוקרים של גירוי באמצעות מתקן מיקרו-הזרקה תוך תאי בהתאם להוראות היצרן.

איור 1: הרכבת זבוב חי לצורך הדמיה של הרגל הקדמית או של תאי עצב של חוטם. (A) הרכבה של הרגל הקדמית: תמונה פי 3.2 של זבוב זכר חי, המראה את הרגליים הקדמיות מהודקות לכיסוי באמצעות נייר דבק. (B) תמונה של 40X של הזבוב מראה כל אחד מהקטעים הטרסליים (T1-5) ואת מיקום סרט הדבק מעל הקטע הטרסלי הראשון ועל המקטע הטרסלי החמישי. (C) הרכבת הפרובוסקיס: פיסת סרט מונחת מעל הרוסטרום כדי לחשוף את קצה החוטם. (D) קצה הפיפטה להוספת גירוי מוחזק מעט מעל הזבוב ואינו יוצר מגע ישיר עם התכשיר.

טבלה 1: מסיסות CH503 בממיסים שונים. DMSO: דימתיל סולפוקסיד. תמיסות אתנול, הקסאן ו-DMSO דוללו ב-dH2O (v/v). המסיסות של CH503 ב-0.2% DMSO הוגבלה רק ל-250 ננוגרם/מ"ל. העלייה ב-ΔF/F עם ממס בלבד הייתה שוות ערך לזו שנצפתה בעת גירוי עם פרומון.