גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

תקציר

מקור: Kinnavane, L., et al. Ex vivo חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית לקליפת המוח האנטורינלית הצידית. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. אלקטרופיזיולוגיה וגירוי אופטוגנטי

1. זיהוי תא היעד.
   1. מניחים את הפרוסה לתוך תא הקלטה שקוע ב 34 ° C מחורר עם נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) בקצב של 2 מ"ל / דקה על ידי משאבה פריסטלטית. משתקים את הפרוסה בעזרת עיגון פרוסה.
   2. תחת מטרת ההגדלה הנמוכה (4x) של מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות הארה אינפרא אדומה אלכסונית, נווט לשכבה 5 של קליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC). מדוד את המרחק ממשטח הפיאל לשכבה הנדרשת.
      הערה: הארה אינפרא-אדומה אלכסונית הושגה על-ידי מיקום נורית LED כמעט אינפרא-אדומה כ-3 מ"מ מתחת למכסה תא ההקלטה בזווית של ~55° למישור הכיסוי (איור 1B). ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית היא טכניקת הדמיה חלופית ונפוצה לאלקטרופיזיולוגיה של פרוסות.
   3. שנו למטרת טבילה במים בהגדלה גבוהה (פי 40) וזהו נוירונים פירמידליים. סמן את מיקום התא על צג המחשב באמצעות tape.
      הערה: לתאי העצב הפירמידליים יש מורפולוגיה משולשת פחות או יותר, עם דנדריטים אפיים בולטים שמקרינים לעבר פני השטח הפיאליים של הפרוסה (איור 2A). ניתן להעריך את בריאות התא על ידי היעדר גרעין מעובה ונראה לעין ובדיקה של קרום הפלזמה שאמור להיראות חלק. אין זה סביר כי תיוג פלואורסצנטי ברור של אקסונים על ידי חלבון היתוך אופסין-פלואורופור יהיה גלוי בעת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. כדי להמחיש תחזיות אקסונליות, בצע אימונוהיסטוכימיה פוסט-הוק באמצעות נוגדן ראשוני כנגד פלואורופור של אופסין והגבר עם נוגדן משני מצומד לפלואורופור באורך גל זהה או דומה.
2. היווצרות של מהדק תיקון תא שלם.​
   1. לייצר מיקרופיפטה מזכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך פיפטה ולמלא אותה בתמיסת הקלטה תוך-תאית מסוננת (120 mM k-gluconate, 40 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 10 mM KCl (אשלגן כלורי), 2 mM NaCl (נתרן כלורי), 2 mM MgATP (מגנזיום אדנוזין טריפוספט), 1 mM MgCl (מגנזיום כלורי), 0.3 mM NaGTP (נתרן גואנוזין טריפוספט), 0.2 mM EGTA (אתילן גליקול חומצה טטראצטית), ו-0.25% ביוציטין המיוצר ב-UPW (מים אולטרה-טהורים), pH 7.25, 285-300 mOsm). הניחו את המיקרופיפטה המלאה במחזיק האלקטרודות על במת ראש מגבר מהדק המדבקות, וודאו שחוט האלקטרודה נמצא במגע עם התמיסה התוך-תאית.
   2. יש להפעיל לחץ חיובי דרך הפה על ידי נשיפה חזקה לתוך פיה (כגון מזרק בנפח 1 מ"ל עם הסרת הבוכנה) המחובר באמצעות צינור ליציאה הצדדית של מחזיק האלקטרודה ולשמור על לחץ על ידי סגירת שסתום תלת-כיווני בשורה. העלו את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס והכניסו את האלקטרודה לתוך המניסקוס עד שניתן יהיה לראות אותה במיקרוסקופ.
   3. פתח את חלון בדיקת האטימה ב- WinLTP16 (או תוכנת רכישה/אוסצילוסקופ אחר), ועם המגבר במצב מהדק מתח, החל פולס ריבועי של 5 mV כדי לקבוע אם התנגדות פיפטה היא 3-6 MΩ.
   4. התקרבו לתא המזוהה וגעו בו עם קצה הפיפטה; הדבר אמור לגרום לשקע בקרום התא (איור 2A; פאנל ימני) ולעלייה קטנה בהתנגדות פיפטה (0.1 MΩ).
   5. שחררו לחץ חיובי והפעילו לחץ שלילי על ידי הפעלת יניקה מתונה בפיה; זה אמור לגרום לעלייה עצומה בהתנגדות פיפטה (>1000 MΩ). כעת ניתן להשאיר את הלחץ ניטרלי. יש להפעיל לחץ שלילי ברמפה שהולכת וגדלה בהדרגה עד שקרום התא נקרע וכתוצאה מכך קיבוליות התא כולו מתארע.
3. תיעוד אירועים סינפטיים מעוררים אופטוגנטית.
   1. הזן current-clamp configuration.
      הערה: ברוב המקרים, שידור סינפטי ארוך טווח הוא גלוטמטרגי, ולכן הקלטה בפוטנציאלים של ממברנה קרוב לפוטנציאל היפוך הכלוריד תבודד בצורה הטובה ביותר את השידור בתיווך קולטן אמפא (AMPAR) ותמזער את המדידה של כל עיכוב הזנה קדימה (FFI) שמתעורר. היפוך כלוריד תלוי בהרכב תמיסת ההקלטה התוך-תאית וה-aCSF וניתן לחשב אותו באמצעות משוואת גולדמן-הודג'קין-כץ; עבור הפתרונות לעיל, זה היה -61.3 mV. לנוירונים פירמידליים בשכבה 5 LEC היה פוטנציאל ממוצע של קרום מנוחה של -62 mV, ובמידת הצורך, נשמרו בפוטנציאל זה על ידי הזרקת זרם קבוע. לחלופין, ניתן להצמיד את התאים למתח לפוטנציאל הרצוי. כדי להקליט תחזיות מעכבות ארוכות טווח16 או כדי להקליט FFI, מהדק מתח בפוטנציאל היפוך קטיון כדי לבודד מוליכות כלוריד GABAergic. כאשר נוירונים מהדקים מתח בפוטנציאלי ממברנה מעל סף פוטנציאל הפעולה, תמיסה תוך-תאית מבוססת צזיום המכילה חוסמי תעלות נתרן מגודרות מתח משמשת לשיפור מהדק המתח ולמניעת התחלת פוטנציאלי פעולה (130 mM CsMeSO4 (צזיום מתאן-סולפונט), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 כלוריד, 4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, 0.25% ביוציטין המיוצר ב-UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm).
   2. באמצעות תוכנה לרכישת נתונים, שלח אותות לוגיקת טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) למנהל התקן LED (דיודה פולטת אור) כדי להפעיל נורית LED מותקנת של 470 ננומטר. נורית ה-LED המותקנת מכוונת לתוך נתיב האור במיקרוסקופ באמצעות קוביות מסנן ואופטיקה מתאימה (איור 1B) כדי להפעיל פולסי אור על הפרוסה באמצעות המטרה 40x לעורר פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים אופטוגנטיים (oEPSPs).
      הערה: פולסי אור יכולים להיות מופעלים באופן פריסומטי / מעל הדנדריטים, מה שיגרום להפעלת אופסינים באקסונים ובוטון הקדם-סינפטי, או שהחוקר יכול להזיז את המטרה לאקסונים הרחק מהתא המוקלט כדי למנוע גירוי יתר של בוטון. משרעת oEPSP מקסימלית תלויה בעוצמת ההיטל הסינפטי, ביעילות של זריקות ויראליות ובאופסין שנעשה בו שימוש. oEPSPs ניתן לטיטרציה למשרעת הרצויה על ידי עוצמת אור משתנה ו/או משך זמן משתנה18; שינוי משך פעימות האור (משך אופייני בין 0.2-5 אלפיות השנייה בתפוקת LED מרבית, המביא לצפיפות אור של 4.4 mW/mm19) מספק אמפליטודות oEPSP עקביות יותר מאשר שינוי תפוקת החשמל של נורית ה-LED.
   3. לחקור תכונות שחרור קדם-סינפטיות (שינוי במתח) על-ידי העברת רכבות של פולסי אור מרובים עם מרווחי גירוי בין-גירויים שונים (איור 2E); יש לנקוט בזהירות בעת פענוח שידור מעורר אופטוגנטית.
   4. חקור פלסטיות לטווח ארוך על ידי התעוררות חוזרת ונשנית של oEPSPs19 או יישום ליגנדות. נטר את משרעת oEPSP במשך 5-10 דקות כדי להבטיח יציבות לפני השראת הפלסטיות, ולאחר מכן נטר עד שתגיע למשרעת יציבה (בדרך כלל 30-40 דקות).
      הערה: רוב האופסינים הנוכחיים אינם מסוגלים לעורר באופן אמין פוטנציאלי פעולה מרובים בתדרים גבוהים, למשל, 100 גירויים המועברים ב -100 הרץ, כפי שמשמש בדרך כלל להשראת LTP.
   5. כדי לאשר oEPSPs הם monosynaptic, לבצע הפעלה over-bouton של המסלול מומר על ידי מיקום המטרה מעל סוכה דנדריטית מגרה בנוכחות 0.5 מיקרומטר tetrodotoxin ו 100 μM aminopyridine. יישום של טטרודוטוקסין יבטל את השידור אם התגובות תלויות פוטנציאל פעולה, והכללה לאחר מכן של aminopyridine תשחזר חלקית את השידור אם oEPSPs נוצרים monosynaptically19,20.
   6. כדי לאפשר לביוציטין למלא את תא העצב, המתינו לפחות 15 דקות לאחר הכניסה לתצורת התא כולו. במהדק מתח, צג קיבוליות הממברנה והתנגדות כניסה.
   7. משכו באיטיות את הפיפטה לאורך זווית הגישה הרחק מהסומה של התא, תוך התבוננות בהיעלמות איטית של מעברי קיבוליות וזרם הממברנה, דבר המצביע על איטום מחדש של קרום התא והיווצרות טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. שימו לב לכיוון הפרוסה ולמיקום התאים בתוך הפרוסה. שים את הפרוסה לתוך PFA (paraformaldehyde) בצלחת 24 בארות, לדגור לילה ב 4 °C, ולאחר מכן להעביר ל 0.1 M PB.
      הערה: ניתן לאחסן פרוסות עד שבוע. אם נדרש אחסון ארוך יותר, שנה את PB (מאגר פוספט) באופן קבוע או השתמש PB המכיל נתרן אזיד (0.02%-0.2% של נתרן אזיד).

תוצאות

איור 1: תא איסוף פרוסות ותצורה אופטית עבור הקלטות חזותיות של תאים שלמים, עירור אופטוגנטי וזיהוי של תאי עצב חיוביים ל-tdTomato. (A) תא איסוף הפרוסות14 מיוצר בהתאמה אישית ממתלה צינור מיקרוצנטריפוגה המודבק על יריעת רשת ניילון ומונח בתוך שבה הוא שקוע בנורות LED מסוג aCSF (B) לעירור של ChR2 (צ'נלרודופסין-2) (470 ננומטר) ו-tdTomato (565 ננומטר) מופנים דרך עדשת מעבה אספרית ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שסתום פיתוי תלת כיווני	קול-פרמר	WZ-30600-02
מטרה פי 40	אולימפוס	LUMPLFLN40XW
4-אמינופירידין	שלום ביו	HB1073
4x מטרה	אולימפוס	PLN4X/0.1
עדשה אכרומטית	אדמונד אופטיקה	49363	מתמקד בספקטרום הראייה ובאינפרא-אדום הקרוב
מיקרוצנטריפוגה Benchtop	בנצ'מרק סיינטיפיק	C1005*
ביוציטין	סיגמא-אולדריץ'	B4261
נימי זכוכית Borosillicate	וורנר אינסטרומנטס	G150F-6
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C5670
מצלמה - Qimaging Retiga אלקטרו	פוטומטריה	01-אלקטרו-M-14-C
קרבצ'ול	טוקריס	2810
פילינג כירורגי כלורהקסידין	Vetasept	XHG008
קוצץ	אנונימי	22445	AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
עדשת מעבה קולימציה	ThorLabs	ACL2520-A
כיסויים	פישר סיינטיפיק בע"מ	10011913
קריוסטט	לייקה	CM3050 S
CsMeSO4	סיגמא-אולדריץ'	C1426
דבק ציאנואקרילט	רפיד אלקטרוניקה בע מ	84-4557
מכשיר לרכישת נתונים	מכשירים לאומיים	USB-6341 BNC
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270
מראה דיכרואית באורך 500 ננומטר	אדמונד אופטיקה	69899
מראה דיכרואית באורך 600 ננומטר	אדמונד אופטיקה	69901
קוביית מראה דיכרואית	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	מילפור	324626
מחזיק אלקטרודה עם יציאה צדדית	הקה	895150
מסנן פליטה	כרומה	59022מ'
מסנן עירור	כרומה	ET570/20x
ג'ל עיניים	Dechra	לובריתל
מברשת צבע עדינה	ציוד מעבדה מדעית	BRU2052
גיליוטינה	מכשירים מדויקים בעולם	DCAP
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375
תמיסת מי חמצן	סיגמא-אולדריץ'	H1009	30% (עם ואט)
איזופלורן	הנרי שיין	988-3245
איזופנטאן	סיגמא-אולדריץ'	M32631
KCl	סיגמא-אולדריץ'	P3911
קיי-גלוקונאט	סיגמא-אולדריץ'	G4500
קוביית מסנן פלואורסצנטיות קינמטית	ThorLabs	DFM1T1
מנהל התקן LED	ThorLabs	LEDD1B
MgATP	סיגמא-אולדריץ'	A9187
MgCl	סיגמא-אולדריץ'	M2670
MgSO4	סיגמא-אולדריץ'	M7506
מושך מיקרואלקטרודות	כלי נגינה של סאטר	P-87
מזרק מיקרו-הזרקה	המילטון	7634-01/00
מחט מזרק מיקרו-הזרקה	המילטון	7803-05	מפרט מותאם אישית: מד 33, אורך 15 מ"מ, סגנון נקודה 4 - 12°
משאבת מזרק מיקרו-הזרקה	מכשירים מדויקים בעולם	UMP3T-1
נורית LED כחולה מותקנת	ThorLabs	M470L5
Na2HPO4.7H2O	סיגמא-אולדריץ'	S9390
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S9888
NaGTP	סיגמא-אולדריץ'	G8877
NaH2PO4	סיגמא-אולדריץ'	S0751
NaH2PO4.H2O	סיגמא-אולדריץ'	S9638
NaHCO3	סיגמא-אולדריץ'	S5761
נורית NIR	אוסרם	SFH4550	אופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC), המשמשת להדמיית IR שבורה של פרוסה, היא שיטה נפוצה נוספת
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	158127
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 6148
מגבר מהדק טלאי	התקנים מולקולריים	700א
משאבה פריסטלטית	מכשירים מדויקים בעולם	מיניסטאר
שקופיות מיקרוסקופ מצופות פולי-L-ליזין	פישר סיינטיפיק בע"מ	23-769-310
תא הקלטה	וורנר אינסטרומנטס	RC-26G
עוגן פרוסה	וורנר אינסטרומנטס	SHD-26-GH/15
מחזיק סטריאוטקסי למקדחה מיקרו	מכשיר הרווארד	75-1874
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S0389
מיקרוסקופ כירורגי	קרל זיס	OPMI 1 FR פרו
מסנן מזרק לפתרון הקלטה תוך תאי	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף	לייקה	DM6 B
תמיסה
aCSF
פתרון חיתוך סוכרוז
פיפ"א