העמסה ופריקה של צבע FM בתיווך מיקרואלקטרודה בתאי עצב של זחלי דרוזופילה

תקציר

מקור: Kopke, D. L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57765">FM מחזור צבע בסינפסה: השוואת דפולריזציה אשלגן גבוהה, גירוי חשמלי ו channelrhodopsin. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, סיבי עצב של זחלי דרוזופילה שקועים בצבע FM, אשר נקשר לשומנים בקרום התא. מיקרואלקטרודת יניקה ופולסים חשמליים מעוררים את תהליך האנדוציטוזה, ומשלבים את צבע FM בשלפוחיות אנדוציטיות שזה עתה נוצרו. שיטה זו, אשר מדמיינת שלבים presynaptic של neurotransmission, שימושי לחקר תפקוד סינפטי ושחרור נוירוטרנסמיטר.

פרוטוקול

1. דיסקציה של דבק הזחל

1. ערבבו ביסודיות 10 חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון עם חלק אחד של חומר ריפוי אלסטומר סיליקון מערכת האלסטומרים.
2. ציפוי זכוכית 22 x 22 מ"מ מכסה עם האלסטומר לרפא על צלחת חמה ב 75 ° C במשך כמה שעות (עד כבר לא דביק למגע).
3. הניחו כיסוי זכוכית יחיד מצופה אלסטומר לתוך תא דיסקציה מזכוכית פלקסי בהתאמה אישית לדיסקציה של הזחל.
4. הכינו את פיפטות הדבק מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרואלקטרודות סטנדרטי כדי להשיג את גודל הטייפר והקצה הרצוי.
5. נתקו בעדינות את קצה המיקרופיפטה, ולקצה השני, חברו צינור פלסטיק גמיש בגודל 2 רגל (קוטר פנימי של 1/32 אינץ', ID; קוטר חיצוני של 3/32 אינץ', OD; קיר בגודל 1/32 אינץ'; עם התאמת פה (קצה פיפטה P2).
6. כהכנה לדיסקציה של הזחל, מלא מיכל קטן (0.6 מ"ל מכסה צינור אפנדורף) בנפח קטן (~ 20 מיקרוליטר) של דבק.
7. מלאו את התא במי מלח (ב-mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 סוכרוז ו-5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) pH 7.2.
8. הוסף נוגדן נגד סוס צנון פרוקסידאז (HRP) מצומד ל-Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; דילל 1:10 ממלאי של 1 מ"ג/מ"ל) לסימון המסוף הפרה-סינפטי NMJ במהלך דיסקציה21,22.
9. בעזרת מברשת צבע עדינה (מידה 2), מסירים כוכב שלישי נודד מבקבוקון המזון ומניחים אותו על זכוכית הכיסוי המצופה באלסטומר.
10. ממלאים את קצה המיקרופיפטה מזכוכית בכמות קטנה של דבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה באמצעות חיבור (שלב 1.5).
11. מקמו את הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה בעזרת מלקחיים והדביקו את הראש לכיסוי המצופה באלסטומר עם טיפה קטנה של דבק באמצעות לחץ אוויר חיובי דרך הפה.
12. חזור על הליך זה עם הקצה האחורי של הזחל, וודא שהחיה מתוחה מתוחה בין שני חיבורי הדבק.
13. בעזרת מספריים (להבים 3 מ"מ), לבצע חתך אופקי (~ 1 מ"מ) בחלק האחורי ולחתוך אנכי לאורך כל קו האמצע הגבי.
14. באמצעות מלקחיים עדינים # 3, להסיר בעדינות את קנה הנשימה הגבי, המעיים, הגוף השמן, ואיברים פנימיים אחרים המכסים את השרירים.
15. חזור על הליך ההדבקה של ארבעת דפנות דופן הגוף; מתח בעדינות את דופן הגוף אופקית ואנכית.
16. הרם את חוט העצבים הגחוני (VNC) באמצעות מלקחיים, חתוך בזהירות את עצבי המנוע עם המספריים ולאחר מכן הסר לחלוטין את ה- VNC.
17. כדי להפסיק את מחזור SV, החלף את מי המלח של הדיסקציה במי מלח נטולי Ca²⁺ (זהה למלח הדיסקציה לעיל ללא CaCl₂).

2. גירוי חשמלי טעינת צבע FM

1. הכינו פיפטת יניקה באמצעות מושך המיקרואלקטרודות כדי לקבל את גודל הטייפר והקצה הנדרש.
2. לטש באש את קצה המיקרואלקטרודה עם מיקרו-פורג' עד שניתן יהיה לשאוב עצב מנוע יחיד בהתאמה הדוקה.
3. החליקו את פיפטת היניקה על מחזיק האלקטרודות במיקרומניפולטור וחברו אותה לצינור הפלסטיק הארוך והגמיש ולמזרק.
4. הגדר פרמטרים של מגרה (לדוגמה, 15 וולט, תדר 20 הרץ, משך 20 אלפיות השנייה וזמן של 5 דקות או דקה.
5. החלף את המלח נטול Ca²⁺ בהכנת הזחל במי מלח FM1-43 לעיל (4 מיקרומטר; 1 mM CaCl₂) במתקן האלקטרופיזיולוגיה.
6. מניחים את ההכנה על שלב המיקרוסקופ ומרימים את הבמה עד למיקוד הזחל ופיפטת היניקה (יעד טבילה במים פי 40).
7. למצוץ לולאה של עצב מוטורי חתוך המעצבב את חצי הקטע שנבחר עם לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי המזרק לתוך אלקטרודת היניקה.
8. בדוק את תפקוד אלקטרודת היניקה עם פרץ קצר של גירוי תוך ניטור חזותי של כיווץ שרירים בחצי הסגמנט שנבחר.
9. לעורר את העצב המוטורי באמצעות פרמטרים נבחרים (שלב 2.4) כדי להניע אנדוציטוזה SV וקליטת צבע FM1-43.
10. יש לשטוף במהירות במי מלח נטולי Ca²⁺ (5x למשך דקה) כדי להסיר לחלוטין את תמיסת הצבע FM1-43.
11. שמור על הכנת הזחל במי מלח טריים ללא Ca+⁺ להדמיה מיידית באמצעות פרוטוקול הדמיה קונפוקלית מלמעלה.
12. שים לב היטב לתמונת NMJ (מקטע, צד ושריר) כדי להבטיח גישה לאותו NMJ לאחר פריקת צבע FM.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת אלסטומרים סיליקון SylGard 184	פישר סיינטיפיק	NC9644388	לשים זכוכית כיסוי לנתיחות
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22x22-1	פישרברנד	12-542-ב	לשים את סילגארד לנתיחות
פלטה חמה עליונה אלומיניום סוג 2200	תרמולין	HPA2235M	לרפא את הסילגארד
תא דיסקציה מזכוכית פרספקס	לא ישים	לא ישים	עבודת יד
נימי זכוכית בורוסיליקט	WPI	1B100F-4	כדי להפוך יניקה דבק micropipettes
מושך מיקרופיפטה מבוסס לייזר	סאטר אינסטרומנט	P-2000	כדי להפוך יניקה דבק micropipettes
צינורות מעבדה Tygon E-3603	אספקת רכיבים ושות'	TET-031A	לפה ופיפטת יניקה
קצה פיפטה P2	ארה"ב סיינטיפיק	1111-3700	עבור פיפטה בפה
0.6-מ"ל מכסה צינור אפנדורף	פישר סיינטיפיק	05-408-120	משמש לשים דבק לדיסקציה
Vetbond 3M	WPI	וטריבונד	דבק המשמש לנתיחות
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	P-217	פורסלין
נתרן כלורי	מיליפור סיגמא	S5886	עבור מלוחים
מגנזיום כלורי	פישר סיינטיפיק	M35-500	עבור מלוחים
סידן כלורי דיהידראט	מיליפור סיגמא	C7902	עבור מלוחים
סוכרוז	פישר סיינטיפיק	S5-3	עבור מלוחים
HEPES	מיליפור סיגמא	H3375	עבור מלוחים
HRP:Alexa Fluor 647	ג'קסון מחקר חיסוני	123-605-021	כדי לתייג קרומים עצביים
מכחול	וינזור וניוטון	94376864793	כדי לתפעל את הזחלים
פינצטה Dumont Dumostar #5	WPI	500233	משמש במהלך דיסקציה
7 ס"מ McPherson-Vannas Microscissors (להבים 3 מ"מ)	WPI	14177	משמש במהלך דיסקציה
FM1-43	פישר סיינטיפיק	T35356	צבע סטיריל פלואורסצנטי
טיימר דיגיטלי	VWR	62344-641	לתזמון טעינה/פריקה של צבע FM
מיקרו-פורג'	WPI	MF200	כדי לשרוף מיקרופיפטות זכוכית פוליש
20mL קצה מזרק להחליק	ב.ד.	301625	כדי לשאוב את האקסון לגירוי חשמלי.
מיקרו מניפולטור (בסיס מגנטי)	נארישיגה	MMN-9	כדי לשלוט באלקטרודת היניקה לגירוי חשמלי
ממריץ	דשא	S48	כדי לשלוט על LED גירוי חשמלי
מיקרוסקופ Zeiss Axioskop	זיס		משמש במהלך גירוי חשמלי.
מטרת טבילה במים 40X Achroplan	זיס		משמש במהלך גירוי חשמלי והדמיה קונפוקלית
Zeiss Stemi מיקרוסקופ עם יציאת מצלמה	זיס	2000-ג	משמש במהלך גירוי channelrhodopsin
מנהל התקן T-Cube LED	ThorLabs	LEDD1B	כדי לשלוט בנורית ה- LED
ספק כוח LED	Cincon אלקטרוניקה ושות'	TR15RA150	כדי להפעיל את נורית ה-LED
מד הספק אופטי ואנרגיה	ThorLabs	PM100D	כדי למדוד את עוצמת ה-LED