ניתוח מחזור שלפוחית סינפטית וקליטת צבע פלואורסצנטי בזחלי דרוזופילה

תקציר

מקור: Kopke, D. L., et al., FM Dye Cycling at the Synapse: השוואת דפולריזציה גבוהה של אשלגן, גירוי חשמלי וצ'נלרודופסין. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקר מחזור שלפוחית סינפטית בצמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה המבטאים צ'נלרודופסין באמצעות צבע פלואורסצנטי. אור כחול מפעיל את הצ'אנלרודופסינים, גורם לזרימת סידן ולאקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. הצבע משתלב בקרומים העצביים ומופנם במהלך אנדוציטוזה, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת. גירוי נוסף של אור כחול גורם לאקסוציטוזה ולשחרור צבע, אשר מוצג על ידי פלואורסצנטיות מופחתת.

פרוטוקול

1. דיסקציה של דבק הזחל

1. ערבבו היטב 10 חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון עם חלק אחד של חומר ריפוי אלסטומר סיליקון מערכת האלסטומרים (טבלה של חומרים).
2. ציפוי זכוכית 22 x 22 מ"מ מכסה עם האלסטומר לרפא על צלחת חמה ב 75 ° C במשך כמה שעות (עד כבר לא דביק למגע).
3. הניחו כיסוי זכוכית יחיד מצופה אלסטומר לתוך תא דיסקציה של פרספקס בהתאמה אישית (איור 1, למטה) כהכנה לדיסקציה של הזחל.
4. הכינו את פיפטות הדבק מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרואלקטרודות סטנדרטי כדי להשיג את גודל הטייפר והקצה הרצוי.
5. נתקו בעדינות את קצה המיקרופיפטה, ולקצה השני, חברו צינור פלסטיק גמיש בגודל 2 רגל (קוטר פנימי של 1/32 אינץ', ID; קוטר חיצוני של 3/32 אינץ', OD; קיר בגודל 1/32 אינץ'; טבלת חומרים) עם התאמת פה (קצה פיפטה P2).
6. מלא מיכל קטן (0.6 מ"ל מכסה צינור אפנדורף) בנפח קטן (~ 20 מיקרוליטר) של דבק (רשימת חומרים) כהכנה לדיסקציה של הזחל.
7. מלאו את התא במי מלח (ב-mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 סוכרוז ו-5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) pH 7.2.
8. יש להוסיף נוגדן נגד סוס צנון פרוקסידאז (HRP) מצומד ל-Alexa Fluor 647 (נוגד HRP:647; לדלל 1:10 מציר של 1 מ"ג/מ"ל) לסימון הטרמינל הפרה-סינפטי של הצומת העצבית-שרירית (NMJ) במהלך דיסקציה.
9. בעזרת מברשת צבע עדינה (מידה 2), מוציאים זחל נודד מבקבוקון המזון ומניחים אותו על זכוכית הכיסוי המצופה באלסטומר.
10. מלאו את קצה המיקרופיפטה מזכוכית בכמות קטנה של דבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר דרך הפה באמצעות חיבור (שלב 1.5).
11. מקמו את הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה בעזרת מלקחיים והדביקו את הראש לכיסוי המצופה באלסטומר עם טיפה קטנה של דבק באמצעות לחץ אוויר חיובי דרך הפה.
12. חזור על הליך זה עם הקצה האחורי של הזחל, וודא שהחיה מתוחה מתוחה בין שני חיבורי הדבק.
13. שימוש במספריים (להבים 3 מ"מ; טבלת חומרים), לבצע חתך אופקי (~ 1 מ"מ) מאחור וחיתוך אנכי לאורך כל קו האמצע הגבי.
14. באמצעות מלקחיים עדינים (#5, טבלה של חומרים), להסיר בעדינות קנה הנשימה הגב, מעיים, גוף שומן ואיברים פנימיים אחרים המכסים את השרירים.
15. חזרו על הליך ההדבקה של ארבעת דפנות דופן הגוף, והקפידו למתוח בעדינות את דופן הגוף הן אופקית והן אנכית.
16. הרם את חוט העצב הגחוני (VNC) באמצעות מלקחיים, חתוך בזהירות את עצבי המנוע במספריים ולאחר מכן הסר לחלוטין את ה- VNC.
17. החלף את מי המלח של הדיסקציה במי מלח נטולי Ca²⁺ (זהה למלח הדיסקציה לעיל ללא CaCl₂) כדי להפסיק את מחזור השלפוחית הסינפטית (SV).

2. הדמיה: מיקרוסקופ קונפוקלי

1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם מטרה טבילה במים 40X כדי לצלם פלואורסצנטיות צבע NMJ (ניתן להשתמש במיקרוסקופ אחר).
2. צלם שריר 4 NMJ של מקטעי בטן 2-4 (NMJ אחרים ניתן לדמיין) ולאסוף תמונות באמצעות תוכנה מתאימה (טבלה של חומרים).
3. השתמש בלייזר HeNe 633 ננומטר כדי לעורר את HRP:647 (עם מסנן מעבר ארוך > 635 ננומטר) ובלייזר Argon 488 ננומטר כדי לעורר FM1-43 (עם מסנן פסים 530-600 ננומטר).
4. קבע תפעולית רווח וקיזוז אופטימליים עבור שני הערוצים.
   הערה: הגדרות אלה יישארו קבועות לאורך שאר הניסוי.
5. קח מחסנית Z קונפוקלית דרך כל NMJ שנבחר מהחלק העליון לחלק התחתון של המסוף הסינפטי המסומן על ידי HRP.
6. שימו לב היטב לתמונת NMJ (קטע, צד ושריר) כדי להבטיח עודף לאותו NMJ בדיוק לאחר פריקת צבע FM.

3. Channelrhodopsin גירוי FM טעינת צבע

1. יש לגדל זחלים המבטאים ChR2 על מזון המכיל את הקו-פקטור ChR2 all-trans retinal (מומס באתנול; ריכוז סופי של 100 מיקרומטר).
2. הניחו את הכנת הזחל בתא הפרספקס על במת מיקרוסקופ דיסקציה המצויד ביציאת מצלמה.
3. חבר נורית LED כחולה (470 ננומטר; טבלת חומרים) לממריץ הניתן לתכנות באמצעות כבל קואקסיאלי ומקם את נורית ה-LED ביציאת המצלמה.
4. מקדו את אלומת האור הכחולה על פונקציית הזחל המנותח באמצעות פונקציית זום המיקרוסקופ.
5. החלף את המלח נטול Ca²⁺ על הכנת הזחל במי מלח FM1-43 לעיל (4 מיקרומטר; 1 mM CaCl₂) בשלב האופטוגנטי.
6. הגדר את פרמטרי ה-LED באמצעות הממריץ (לדוגמה, 15 וולט, תדר 20 הרץ, משך זמן של 20 אלפיות השנייה וזמן של 5 דקות (איור 2)).
7. התחל את גירוי האור ועקוב עם טיימר למשך הזמן שנקבע מראש של תקופת הגירוי האופטוגנטי (למשל, 5 דקות; איור 2).
8. כאשר הטיימר נעצר, הסר במהירות את תמיסת הצבע FM והחלף במי מלח נטולי Ca²⁺ כדי להפסיק את פעולת SV.
9. יש לשטוף ברצף מהיר עם מי מלח נטולי Ca²⁺ (5x למשך דקה אחת) כדי להבטיח שתמיסת הצבע FM תוסר לחלוטין.
10. שמור על הכנת הזחל במי מלח טריים ללא Ca+⁺ להדמיה מיידית עם המיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות פרוטוקול הדמיה.
11. שימו לב היטב לתמונת NMJ (קטע, צד ושריר) כדי להבטיח גישה לאותו NMJ בדיוק לאחר פריקת צבע FM.

4. Channelrhodopsin גירוי: פריקת צבע FM

1. החלף את המלח נטול Ca²⁺ במי מלח רגילים (ללא צבע FM1-43) בשלב מיקרוסקופ הדיסקציה עם יציאת מצלמה LED הממוקדת בזחל.
2. הגדר את פרמטרי המגרה לפריקה (לדוגמה, 15 וולט, תדר 20 הרץ, משך 20 אלפיות השנייה וזמן של 2 דקות (איור 2).
3. התחל את גירוי האור ועקוב עם טיימר למשך הזמן שנקבע מראש של תקופת הגירוי האופטוגנטי (למשל, 2 דקות; איור 2).
4. כאשר תקופת הטיימר מסתיימת, הסר במהירות את תמיסת הצבע FM והחלף במי מלח נטולי Ca²⁺ כדי להפסיק את מחזור SV.
5. יש לשטוף ברצף מהיר במי מלח ללא Ca²⁺ (5x למשך דקה) כדי להבטיח שהצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
6. שמור על הכנת הזחל במי מלח טריים ללא Ca+⁺ להדמיה מיידית עם המיקרוסקופ הקונפוקלי.
7. הקפד לצלם את פלואורסצנטיות הצבע FM1-43 באותו NMJ שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקליות.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול טעינת צבע FM1-43 ב-Drosophila NMJ. דיסקציה של דבק הזחל מייצרת הכנה עצבית-שרירית שטוחה, כאשר חוט העצב הגחוני (VNC) מקרין עצבים סגמנטאליים מקו האמצע הגחוני (Vm) למערכי שרירי דופן הגוף החוזרים על עצמם (שלב א). ה-VNC נחתך לחופשי, וכל דיסקציית הזחל מודגרת בתמיסת FM1-43 ורודה (4 מיקרומטר) כהכנה לגירוי (שלב ב'). FM1-43 נטען בפרדיגמת גירוי נבחרת (שלב 3); עם אפשרויות של דפולריז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת אלסטומרים סיליקון SylGard 184	פישר סיינטיפיק	NC9644388	לשים זכוכית כיסוי לנתיחות
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22x22-1	פישרברנד	12-542-ב	לשים את סילגארד לנתיחות
פלטה חמה עליונה אלומיניום סוג 2200	תרמולין	HPA2235M	לרפא את הסילגארד
תא דיסקציה מזכוכית פרספקס	לא ישים	לא ישים	עבודת יד
נימי זכוכית בורוסיליקט	WPI	1B100F-4	כדי להפוך יניקה דבק micropipettes
מושך מיקרופיפטה מבוסס לייזר	סאטר אינסטרומנט	P-2000	כדי להפוך יניקה דבק micropipettes
צינורות מעבדה Tygon E-3603	אספקת רכיבים ושות'	TET-031A	לפה ופיפטת יניקה
קצה פיפטה P2	ארה"ב סיינטיפיק	1111-3700	עבור פיפטה בפה
0.6-מ"ל מכסה צינור אפנדורף	פישר סיינטיפיק	05-408-120	משמש לשים דבק לדיסקציה
Vetbond 3M	WPI	וטריבונד	דבק המשמש לנתיחות
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	P-217	פורסלין
נתרן כלורי	מיליפור סיגמא	S5886	עבור מלוחים
מגנזיום כלורי	פישר סיינטיפיק	M35-500	עבור מלוחים
סידן כלורי דיהידראט	מיליפור סיגמא	C7902	עבור מלוחים
סוכרוז	פישר סיינטיפיק	S5-3	עבור מלוחים
HRP:Alexa Fluor 647	ג'קסון מחקר חיסוני	123-605-021	כדי לתייג קרומים עצביים
HEPES	מיליפור סיגמא	H3375	עבור מלוחים
מכחול	וינזור וניוטון	94376864793	כדי לתפעל את הזחלים
פינצטה Dumont Dumostar #5	WPI	500233	משמש במהלך דיסקציה
7 ס"מ McPherson-Vannas Microscissors (להבים 3 מ"מ)	WPI	14177	משמש במהלך דיסקציה
FM1-43	פישר סיינטיפיק	T35356	צבע סטיריל פלואורסצנטי
טיימר דיגיטלי	VWR	62344-641	לתזמון טעינה/פריקה של צבע FM
LSM 510 META מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר	זיס		להדמיית הסמנים הפלואורסצנטיים
זן 2009 SP2 גירסה 6.0	זיס		תוכנה להדמיה על קונפוקל
לייזר HeNe 633nm	לאסוס	כדי לעורר את HRP:647 במהלך הדמיה
ארגון לייזר 488nm	לאסוס		כדי לעורר את צבע FM במהלך הדמיה
מיקרו-פורג'	WPI	MF200	כדי לשרוף מיקרופיפטות זכוכית פוליש
ממריץ	דשא	S48	כדי לשלוט על LED גירוי חשמלי
All-trans Retinal	מיליפור סיגמא	₪600	קו-פקטור חיוני עבור ChR2
Zeiss Stemi מיקרוסקופ עם יציאת מצלמה	זיס	2000-ג	משמש במהלך גירוי channelrhodopsin
לד 470nm	ThorLabs	M470L2	משמש להפעלת ChR
מנהל התקן T-Cube LED	ThorLabs	LEDD1B	כדי לשלוט בנורית ה- LED
ספק כוח LED	Cincon אלקטרוניקה ושות'	TR15RA150	כדי להפעיל את נורית ה-LED
מד הספק אופטי ואנרגיה	ThorLabs	PM100D	כדי למדוד את עוצמת ה-LED
מטרת טבילה במים 40X Achroplan	זיס	משמש במהלך גירוי חשמלי והדמיה קונפוקלית