מדידת פוטנציאלי פעולה מורכבים של שרירים על ידי גירוי העצב הפרני בחולדה

תקציר

מקור: Martin, M. et al. הערכה תפקודית ומורפולוגית של עצבוב הסרעפת על ידי נוירונים מוטוריים פרניים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר רישום פוטנציאלים של פעולת שרירים מורכבים (CMAPs) בסיבי שריר הסרעפת בחולדה באמצעות גירוי עצבי פרני. גירוי דופק חשמלי בעוצמה גבוהה של העצב הפרני יוצר פוטנציאלי פעולה בסיבי שריר הסרעפת, אשר נצפים על ידי קבלת עקומת התגובה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת החיה:

1. הרדימו את החולדה באמצעות ממסים נדיפים (איזופלורן) בשיעור של 1-2% המועברים לתוקף או בזריקה (קטמין, קסילזין, אצפרומזין). מינון ההרדמה בהזרקה הוא כדלקמן: 95.0 מ"ג / ק"ג קטמין, 10.0 מ"ג / ק"ג של xylazine, 0.075 מ"ג / ק"ג של acepromazine.
   הערה: אנו משתמשים בהצלחה הן בממסים נדיפים והן בגישות הרדמה בהזרקה בעת ביצוע פרוטוקול הקלטה CMAP זה, ללא העדפה.
2. יש לשמור על בעל החיים בעומק ההרדמה המתאים לפני תחילת הניתוח, עד לסיום הניתוח ועד כניסת בופרנורפין לתוקף לאחר הניתוח. ודא הרדמה נאותה על ידי צביטה קצרה בבוהן כדי לקבוע כי תגובת נסיגה אינה מעוררת. בנוסף, בדוק את רפלקס הקרנית עם צמר גפן. במהלך ההליך הכירורגי, לקבוע כי קצב הלב וקצב הנשימה לא גדלו, מה שמרמז כי עומק ההרדמה הפך קל מדי.
3. יש למרוח משחה וטרינרית על עיני בעל החיים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
4. על המנתח לשטוף את ידיו בחומר חיטוי (פילינג כלורהקסידין) לפני תחילת הניתוח. המנתח צריך ללבוש כפפות סטריליות, מסכת פנים וחלוק או חלוק מעבדה נקי. יש לשטוף את כל המכשירים ולבצע autoclaved לפני הניתוח. הוסף פס מחוון עיקור בתוך ערכת המכשירים לפני החצייה האוטומטית ברמת המכשירים כדי לוודא שהעיקור הושלם. על המנתח לוודא שכל הקו ברצועה שחור לפני תחילת הניתוח. הדביקו גם את החלק החיצוני של הקופסה עם סרט הדבקה אוטומטי. אם יש לבצע ניתוח במספר בעלי חיים באותו יום, יש לנקות את המכשירים בין הניתוחים ולעקר במעקר חרוזי זכוכית. במידת הצורך, יש לעקר את שני קצוות המכשיר במעקר חרוזי הזכוכית על ידי הנחת ידית המכשיר במעקר לזמן המתאים, הוצאת המכשיר עם המוסטט סטרילי, קירורו בשדה סטרילי ולאחר מכן הכנסת הקצה הפונקציונלי של המכשיר למעקר חרוזי הזכוכית לתקופה המתאימה.
5. לאחר שהחיה מורדמת, הניחו אותה על לוח ניתוח כאשר המשטח הגבי כלפי מטה והבטן פונה כלפי מעלה, כך שניתן יהיה להשתמש בסרט הדבקה כדי לאבטח את הגפיים הקדמיות של החיה ללוח ניתוח.
6. יש לגלח את משטח הגחון בצורה קאודלית החל מבסיס הגולגולת ולוודא שהאזור סביב הבטן משני צדי קו האמצע מגולח בהתאם לתרשים חצי הסרעפת. יש למרוח פובידון-יוד על פני השטח המגולחים של העור.

2. הכנה להקלטות CMAP:

1. לאחר הכנה של בעלי חיים, הניחו אלקטרודה טחונה תת-עורית לתוך הזנב (איור 1).
2. מניחים את אלקטרודת הייחוס תת עורית באזור הבטן התחתונה הנגדית.
3. הניחו את הג'ל המוליך על רצועת משטח הדבקה עצמית או אלקטרודת הקלטת דיסק (מידות אלקטרודת רצועת המשטח: 0.5 x 3 ס"מ), ולאחר מכן הניחו את אלקטרודת המשטח לרוחב לאורך השוליים הקוסטליים החד-צדדיים.
4. מניחים אלקטרודות מעוררות במרחק טרנסעורי של 0.5 ס"מ זו מזו לרוחב קנה הנשימה ועליונות על עצם הבריח. הכנס את האלקטרודות בעומק של כ-1.0 ס"מ דרך העור. אבטח את האלקטרודות ביד כך שמיקומם לא יזוז עם הגירויים הבאים.
   הערה: אלקטרודות מעוררות זווית 90° ביחס לעור במקום ההחדרה.

3. הקלטות פוטנציאל פעולת שרירים מורכב (CMAP):

1. קבל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מגרה/מגבר ואחריו ניתוח נתונים בסיוע מחשב.
2. פרמטרי הגירוי של גירוי משיכה יחיד צריכים להיות 0.5 mssec, 1.0 Hz פולסים supramaximal. המשרעת של הגירוי צריכה להיות בין 6.0 ל-8.0 וולט (איור 2A).
   הערה: במסגרת ניסוי, השתמש בעוצמת גירוי עם אותה משרעת על פני בעלי חיים. המטרה היא למקסם את משרעת התגובה על ידי שימוש באמפליטודה המינימלית של גירוי. חשוב לציין כי התגובה הראשונית המתרחשת בזמן הגירוי היא חפץ גירוי. בנוסף, יש להקפיד על קבלת תגובת CMAP שלפניה קו בסיס יציב/שטוח לאחר ממצא הגירוי, ואחריו תגובת CMAP מהירה. כדי לקבל תגובה כזו, ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הגירוי ו / או אלקטרודות הקלטה.
3. המתינו 30 שניות בין גירוי לגירוי וחזרו על 10 גירויים ברציפות כדי לקבל את התגובה הממוצעת (איור 2B-C). מדדו את המשרעת מקו הבסיס ועד לשיא (איור 2A). בצע גירוי עצבי פרני במהלך השלב של מחזור הנשימה של בעל החיים כאשר העצב / הסרעפת הפרנית אינם מופעלים. ניתן לחזור על ההליך על אותה חיה עבור הסרעפת ההמי-צדדית.
4. לאחר ההקלטה הסופית של CMAP, יש לנקב את בעל החיים אם תתבצע צביעת צומת עצבית-שרירית בסרעפת (NMJ). בצע הקלטות CMAP שוב ושוב על אותו בעל חיים בערך פעם בשבוע (או במרווחי זמן לפי בחירתך).
5. לאחר רישומי CMAP הישרדותיים, יש לאפשר לבעל החיים להתאושש על כרית חימום מים חמים במחזור, ולנטר ברציפות במהלך ההתאוששות עד שהוא ער ושוכב. אין להחזיר בעל חיים שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
6. לאחר השכיבה החמורה, יש לפקח על בעל החיים כל 12 שעות במשך 48 השעות הראשונות (פעם ביום לאחר מכן). אם בעל החיים נראה מיובש (עור רפוי, חוסר שינה), יש לתת נוזלים (תמיסת רינגרים מניקים; תת עורית; 1-2 מ"ל לכל זריקה, עם האתרים מסובבים; 2 פעמים ביום) עד להתייצבות המשקל ואובדן הנוזלים לאחר הניתוח. לספק לבעלי חיים מזון מרוכך בצלחות קטנות במהלך התקופה החריפה שלאחר הניתוח במידת הצורך כדי לעודד אכילה אם הם לא יכולים להגיע למזין מכסה מוט התיל.
7. מתן buprenorphine במינון של 0.05 מ"ג / ק"ג לפני סוף הניתוח ולאחר מכן במרווחים של 12 שעות במשך 24 השעות הראשונות (ותלוי בסימני כאב / מתח לאחר מכן) באמצעות הזרקה תת עורית (האתר מסובב). אם מבחינים בסימני כאב או מצוקה לאחר מכן, טפלו בבעלי חיים עם בופרנורפין. סימנים המעידים על כאב/מצוקה כוללים חוסר פעילות, קולות, חוסר אכילה או שתייה (התייבשות), ירידה מוגזמת במשקל, שמירה, כרסום מוגזם או גירוד במקום החתך. קריטריונים נוספים המשמשים לקביעת כאב ומצוקה כוללים חוסר תגובה לגירויים חיצוניים, קול חולף או ללא התגרות, נשימה מאומצת או לא תקינה, הפרשות אף אדמדמות-חומות מתמשכות, זקפה מסומנת. כמו כן, עקוב אחר ראיות להיגיינה לקויה שתצביע על בעלי חיים חולים. אם בעל החיים עדיין נמצא במצוקה לאחר 72 שעות של טיפול (על פי קריטריוני הכאב/לחץ שתוארו לעיל, ולאחר קבלת פרוטוקול משכך כאבים שתואר לעיל), יש להרדים את בעל החיים.

תוצאות

איור 1: מיקום אלקטרודות CMAP. אלקטרודת הקרקע ממוקמת תת עורית לתוך הזנב. אלקטרודת הייחוס ממוקמת לתוך הבטן. אלקטרודת רישום פני השטח ממוקמת לרוחב לאורך השוליים הקוסטליים החד צדדיים. אלקטרודות מעוררות מתוארות כאדומות ושחורות כאחד.

איור 2: הקלטות וניתוח CMAP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מספריים קפיציות קטנות	כלים מדעיים משובחים	15002-08
מלקחיים דיסקציה	כלים מדעיים משובחים	11295-51
תוכנה להקלטות CMAP	היקף 3.5.6; עדי
אלקטרודות משטח דיסק	נטורולוגיה נוירולוגית	019-409000
אלקטרודות מחט תת-עורית	נטורולוגיה נוירולוגית	019-453100
ג'ל מוליך	אקווסוניק	122-73720
מערכת סטימולטור/הקלטה להקלטות CMAP	ממריץ ADI Powerlab 8SP
מגבר להקלטות CMAP	ביוAMP