ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

תקציר

מקור: Hancock, C. E. et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה להדמיית סידן in vivo באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בזבובים. הוא מתאר את השלבים להכנת הזבובים למיקרוסקופיה, ביצוע מיזוג חוש הריח, והדמיית זרימת סידן הנגרמת על ידי ריח.

פרוטוקול

1. זבובי פירות טרנסגניים, Drosophila melanogaster

1. נקבות צולבות של זבובים בתוליים וזבובים זכרים (הגדלים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של 60% במחזור בהיר/חושך של 12 שעות) הנושאים את מבני Gal4 ו-UAS הרצויים, בהתאמה, כדי לייצר זבובים שבהם נוירונים ספציפיים בעלי עניין מבטאים אינדיקטור סידן מקודד גנטית.
2. גיל הצאצאים הנקביים של הצלב הנ"ל עד שהם בטווח של 3-6 ימים לאחר האקלוסיה. נקבות זבובים עדיפות בגלל גודלן מעט גדול יותר.

2. הכנת זבוב הפירות להדמיית סידן in vivo

1. בחרו נקבת זבוב אחת ובצעו הרדמה על קרח למשך לא יותר מ-5 דקות.
2. בעזרת מלקחיים עדינים, מקמו את הזבוב בתא ההדמיה (מוצג באיור 1c). ודא שבית החזה והרגליים נמצאים במגע עם חוטי החשמל בתחתית התא ושהראש מונח שטוח. תקן את מיקום הזבוב באמצעות סרט דבק שקוף.
   הערה: פרוטוקול זה דורש תא מותאם אישית שבו הזבובים מקובעים, כאשר קפסולת הראש נגישה לפתיחה, והזבובים מסוגלים לקבל גם גירויי ריח לאנטנות וגם מכות חשמל לבית החזה ולרגליים (איור 1).
3. באמצעות להב אזמל כירורגי המקובע לידית האזמל (ראה טבלת חומרים), חותכים חלון בסרט סביב ראש הזבוב, ומשאירים את האנטנות מכוסות ורק החלק הקדמי ביותר של בית החזה חשוף.
4. הקיפו את הצדדים והאחוריים של הראש בדבק מרפא אור כחול, המטופל בזהירות באמצעות סיכת חרקים המוחזקת על ידי לסתות קעורות-קמורות. הגדר את הדבק באמצעות מנורת LED פולטת אור כחול.
5. בדקו שהדבק מסודר לחלוטין ונקו כל שארית דבק לא קשיח מהמשטח הגבי של ראש הזבוב.
6. יש למרוח טיפה מתמיסת רינגר (ראו טבלת חומרים) כדי לכסות את הקוטיקולה החשופה של הראש.
7. בעזרת סכין דקירה בעלת להב דק מאוד, חותכים דרך הקוטיקולה. להסרה היעילה ביותר של הקוטיקולה, יש לחתוך תחילה את החלק האחורי של הראש תוך שימוש באוצ'לי כנקודת מוצא. לאחר מכן, חתכו כל צד, מדיאלי לעיניים, כדי ליצור דש של הקוטיקולה שניתן לקרוע בקלות באמצעות מלקחיים.
8. הסר את כל הקוטיקולה העודפת שעלולה לחסום את אזור העניין במוח.
9. בזהירות לנקות את פני השטח הגבי של כל קנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים, הימנעות הפרעה של רקמת המוח עצמה. הסר ורענן את התמיסה של רינגר (ראה טבלת חומרים) כנדרש כדי לנקות את האזור מפסולת רקמות.
10. הניחו את מחט העברת הריח ההיפודרמי במיקום של כ-1 ס"מ מראש הזבוב. ודא שאין שום דבר שיכול להפריע להעברת ריח לאנטנות.
11. במיקרוסקופ, חברו את תא ההדמיה למערכת העברת הריח באמצעות מחט העברת הריח ההיפודרמית.
12. כדי לאפשר לזבוב להתאושש באופן מלא מהרדמה וניתוח, ולהסתגל לזרימת האוויר, יש לבצע בשלב זה תקופת מנוחה של 10 דקות.

3. הדמיית סידן In vivo

1. השתמש במיקרוסקופ מולטיפוטון המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים (ראה טבלת חומרים), המותקן על שולחן מבודד רטט. להדמיה של מחווני סידן מבוססי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כוונן את הלייזר לאורך גל עירור של 920 ננומטר והתקן מסנן פס GFP.
2. בעזרת ידית הכוונון הגסה Z, סרקו דרך ציר Z במוח ואתרו את אזור העניין במוח. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה באזור זה בלבד כדי למזער את זמן הסריקה ולסובב את תצוגת הסריקה כך שהחלק הקדמי של הראש פונה כלפי מטה.
3. התאם את גודל המסגרת ל- 512 x 512 פיקסלים, את מהירות הסריקה ל- >- 4 הרץ ואת אזור הסריקה (בממד Y) כך שהנוירונים המעניינים יהיו מכוסים.

4. הדמיה של מעברי סידן המעוררים ריח באמצעות מיזוג חוש הריח

1. השתמש במערכת העברת ריח שיכולה לספק מספר גירויי ריח באופן מדויק באופן זמני.
   1. השתמש במחשב נוסף כדי לשלוט במכשיר, ולתקשר עם תוכנת מיקרוסקופ ההדמיה כדי לתאם גירויי ריח עם לכידת תמונה במהלך ניסויים.
   2. הפעל חבילת מאקרו מתוכנתת מראש המסוגלת לקשר בין תוכנת רכישת התמונה לבין התוכנית להעברת ריח (לדוגמה, חבילת מאקרו VBA המותקנת בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, ראה טבלת חומרים) המגיבה לגורם מפעיל קלט חיצוני המסופק על-ידי הפעלת פרוטוקול העברת ריח בתוכנית נפרדת).
2. התחל את המדידה על ידי ניטור מעברי סידן "טרום אימון"/נאיביים המעוררים ריח ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים וקצב פריימים של 4 הרץ. ספק גירוי ריח של 2.5 שניות ומשני צדדיו רכישת תמונה נוספת עבור 6.25 שניות לפני תחילת הריח (כדי לקבוע ערך בסיסי F₀) ו- 12.5 שניות לאחר היסט ריח. חזרו על הפעולה עם ריח שני ולאחר מכן עם ריח שלישי.
3. המשך 3 דקות לאחר מדידה זו עם התניה קלאסית ("אימון") הזבוב.
   1. בחר אחד מהריחות המוצגים בשלב "טרום האימון" כדי להפוך לריח הגירוי המותנה (CS⁺) וריח אחר שיהפוך לריח CS. הצג את ריח CS⁺ באמצעות מערכת העברת ריח נשלטת מחשב למשך 60 שניות לצד שתים עשרה מכות חשמל של 90 וולט.
   2. לאחר הפסקה של 60 שניות, הציגו את ריח ה-CS בלבד במשך 60 שניות. השתמשו כריחות 4-מתילציקלוהקסנול ו-3-אוקטאנול. אין להציג את הריח השלישי (למשל, 1-אוקטן-3-ol) במהלך אימון זה, שכן הוא משמש כבקרה רק לפני (שלב 4.2.) ואחרי (שלב 4.4) שלב האימון.
4. מדדו שוב את מעברי הסידן "שלאחר האימון" על ידי חזרה על פרוטוקול גירוי הריח "לפני האימון" (שלב 4.2.) 3 דקות לאחר סיום שלב האימון (שלב 4.3).
   הערה: העיתוי של שלב זה צריך לשקף את זמן העניין לאחר היווצרות הזיכרון (למשל, בצע שלב זה 3-4 דקות לאחר שלב ההתניה כדי לחקור זיכרון לטווח קצר). בדרך כלל, זבובים יכולים לשרוד מספר שעות בהכנה זו.
5. שמרו קובצי הדמיה בתבנית מתאימה (לדוגמה, Tiff) לצורך ניתוח תמונה מאוחר יותר.

5. ניתוח תמונות

1. כדי לנתח תמונות, פתח קובצי Tiff (או קבצים דומים) בתוכנת ניתוח תמונות, כגון Fiji.
2. יישרו את הערימות באמצעות אלגוריתם תיקון תנועה כדי להבטיח תנועה מינימלית בכיווני X ו- Y. מחק הקלטות המציגות תנועה חזקה בציר Z.
3. בחר את כלי התוכנה המשמש לסימון אזור עניין (ROI) סביב האזור שיש לבחון. זה צריך להיות מדויק ככל האפשר כדי להגביל את ההשפעה של פלואורסצנטיות רקע.
4. השתמש בכלי התוכנה המתאים כדי לחלץ נתוני עוצמת פלואורסצנטיות זמנית כקובצי נתונים מההחזר על ההשקעה שנבחר, כך שנוצר ערך לכל מסגרת בהקלטה.
5. פתח את הנתונים באמצעות תוכנית ניתוח נתונים כדי לחשב את ערכי ΔF/F₀ עבור כל מעקב ריח. F₀ = פלואורסצנטיות ממוצעת ב-2 שניות לפני הופעת הריח. ΔF = ההבדל בין הפלואורסצנטיות הגולמית במסגרת נתונה לבין F₀. מתוך ערכים אלה, חשב ערך ΔF/F₀ עבור כל מסגרת, אשר ניתן להתוות כנגד הזמן כדי לשקף פלואורסצנטיות יחסית לאורך תקופת גירוי הריח.

תוצאות

איור 1: בניית תא הרכבה והכנת זבוב להדמיה.(א) שלבים לבניית תא הרכבה לזבובים. הבסיס בנוי משקופית מיקרוסקופ סטנדרטית (1) מכוסה ברשת פלסטיק עדינה (2). שני חוטי חשמל הנושאים מטענים מנוגדים (3) מודבקים למגלשה משני הצדדים. החוטים מופשטים ומכופפים כדי לחצות את המגלשה (4) במקביל זה לזה אך לא במגע. שכבות של סרט הדבקה שקוף (5) מתווספות עד הגעה לגובה של זבוב (כ 1 מ"מ). תעלה נחתכת דרך הסרט במאונך...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-אוקטן-3-ol	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	O5284	כימיקל המשמש כחומר ריחני
3-אוקטאנול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	218405	כימיקל המשמש כחומר ריחני
4-מתילציקלוהקסנול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	153095	כימיקל המשמש כחומר ריחני
מסנן פסים עבור EGFP (525/50 ננומטר)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה
סרט הדבקה שקוף	Tesa SE, Norderstedt, גרמניה		סרט הדבקה שקוף סטנדרטי
לסתות קעורות-קמורות	Fine Science Tools, נורת' ונקובר, קנדה	10053-09	מחזיקי להבים עם לסתות קעורות-קמורות
מלקחיים עדינים	Fine Science Tools, נורת' ונקובר, קנדה	11412-11	מלקחיים עם קצה 0.1 × 0.06 מ"מ
מחט היפודרמית	סטריקן - ב. בראון, Melsungenk, גרמניה	4665120	1.20x40 מ"מ
סיכות Minutien חרקים	Fine Science Tools, נורת' ונקובר, קנדה	26002-10	קוטר 0.1 מ"מ, קצה 0.0125 מ"מ
קנטופלואו	Kent Express Dental Supplies, גילינגהם, בריטניה	953683	דבק מרפא אור כחול
שקופית מיקרוסקופ	Carl Roth GmbH & Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה	656.1	שקופית מטרה סטנדרטית 76 x 26 מ"מ
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	M8410	משמש כמדלל לריחות
לייזר Ti-Sapphire נעול מצב Chameleon Vision 2	Coherent Inc., סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)		לייזר פמטו-שנייה אינפרא אדום
מיקרוסקופ מולטיפוטון LSM 7MP מצויד בגלאי BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה		מיקרוסקופ מולטיפוטון, חברות מרובות מספקות מכשירים דומים.
מטרת טבילה במים Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה	421452-9900-000	מטרה W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
הפתרון של רינגר	נ.א.	נ.א.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM סוכרוז, pH = 7.4
סכין דקירה	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, רידינג, פנסילבניה, ארה"ב	72-1551	5.0 מ"מ עומק להב ישר מוגבל
להב אזמל כירורגי	סוואן-מורטון, שפילד, בריטניה	303	מוצרים מס' 11
ידית אזמל כירורגית	סוואן-מורטון, שפילד, בריטניה	907	מק"ט: 7S/S
תוכנת Visual Basics of Applicatons (VBA) לקבלת טריגר ממכשיר העברת הריח וממכשיר יישום ההתחשמלות (ספק כוח) לאינטראקציה עם תוכנת ZEN מבית Zeiss השולטת במיקרוסקופ.	כתוב בהתאמה אישית וזמין לפי בקשה	נ.א.	נ.א.