נוירומודולציה הנגרמת על ידי אולטרסאונד באמצעות מערכת מערך מיקרואלקטרודות

Abstract

מקור: Liang, R. et al., Focused Ultrasound Neuromodulation of Human in vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (2024)

סרטון זה מדגים את השיטה לגרימת אפנון הפעילות העצבית בתאי עצב אנושיים שמקורם בתאי גזע בעלי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במערך מיקרואלקטרודות רב-באר, או מערכת MEA באמצעות מתמר אולטרסאונד ממוקד.

Protocol

1. הכנת חומרים

1. שאפו את מדיום התרבית והשתמשו בו כדי למלא באר אחת בלוח תרבית נוירונים בן 24 בארות באמצעות מערך מיקרואלקטרודות משובץ (MEA) (איור 1A).
2. עקרו את ממשק הפרפילם, את הגומייה ואת חרוט האולטרסאונד הממוקד (FUS) עם קרום הגומי שלו תוך שימוש באתנול 70% למשך 10 דקות, והניחו אותם במכסה האדים להרכבה מאוחרת יותר.
3. דגה 300 מ"ל של מים deionized ו 50 מ"ל של ג'ל צימוד. צנטריפוגה את המים והג'ל ב 160 x גרם במשך 5 דקות כדי למנוע גרימת cavitation בתוך המדיום צימוד.
   הערה: המקור המקורי של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (HiPSCs) הוא מקווי תאי GM01582 ו-CIPS. בממוצע, צפיפות של 5 x 10⁴ נוירונים מוטוריים ו 2.5 x 10⁴ אסטרוציטים לכל באר ניתן להשיג.

2. חיבור והגדרה של הציוד ההיקפי

1. הצמידו את חרוט ה-FUS למתמר באמצעות ברגים, ואטמו את החרוט בקרום גומי גמיש במכסה מנוע סטרילי מאוורר. מלאו את החרוט במים שעברו דה-גזים ודה-יוניזציה (DG-DI) משלב 1.3, והבטיחו היעדר בועות בקונוס כדי למנוע קוויטציה.
2. השתמשו במוט הברגה מותאם אישית כדי לאבטח את המחזיק המודפס בתלת-ממד למסגרת (איור 1B). מקם את המסגרת כך שראש מתמר FUS יהיה מעל הבאר שתעורר.
3. השתמש בגומייה כדי לאבטח את הפרפילם מעל הבאר על צלחת MEA בעלת 24 בארות המכילה את המדיום ואת HiPSCs.
4. הכן את מערכת FUS על ידי חיבור אלקטרוניקה של מנהל ההתקן העורפי של מתמר האולטרסאונד, במקרה זה, פלט כוח המתמר (TPO), לשקע חשמל של 100-240 וולט וחיבור הרשת התואמת ל- TPO ולמתמר FUS. רשת ההתאמה מבטיחה צימוד חשמלי יעיל בין המתמר ל-TPO.
5. חבר את מערכת MEA לשקע חשמל (100-240 וולט) (איור 2B, חיבור 5). חבר את יציאת סנכרון מערכת MEA ל- TPO (איור 2B, חיבור 3). חיבור זה יסנכרן את איסוף הנתונים על ידי מערכת MEA עם גירוי FUS.
6. הניחו את צלחת MEA בעלת 24 הקידוחים במערכת MEA, והסירו את המכסה כדי לאפשר מגע ישיר בין המתמר לבאר. הניחו את המתמר 5-10 מ"מ מעל לוח הבאר כדי לפנות מקום לג'ל הצימוד נטול הגזים, כפי שמתואר בשלב 3.2 (איור 2A ואיור 1B).

3. גירוי ורכישת אות עצבי

1. הגדר את פרמטרי FUS בלוח הבקרה של TPO (טבלה 1).
2. מרחו את ג'ל הצימוד על גבי הפרפילם, והורידו את מתמר FUS לתוך ג'ל הצימוד, כדי להבטיח מגע עם הג'ל עם מינימום בועות אוויר (איור 1A).
3. התחל את הקלטת מערכת MEA על ידי לחיצה על התחלה כפתור בממשק המשתמש.
4. התחילו את הסוניקציה של FUS על-ידי לחיצה על הכפתור הימני התחתון ב-TPO (איור 2A, תווית 7), והמתינו לפחות 5 דקות בין כל סבב של סוניקציה כדי לאפשר לתאי העצב לחזור למצב בסיסי.
5. השתמשו בפעימת ההדק שנוצרת על-ידי מערכת FUS כדי ליישר את רצף הגירוי של FUS לרישום MEA (איור 1B, חיבור 3).

טבלה 1: פרמטרים של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המוגדרים ב- TPO

פרמטר	ערך
הספק מרבי/Ch	1.200 ואט
עובדתית	0.749 ואט/ערוץ
ISPPA	10.79 ואט/ס"מ2
ISPTA	0.05 ואט/ס"מ2
אורך פרץ	0.100 מטר/שניה
תדירות	250.00 קילו-הרץ
מוקד	39.800 מ"מ
תקופה	20.000 מטר/שניה
טיימר	60,000 שניות

Results

איור 1: נוירומודולציה FUS עם מערך מיקרואלקטרודות רב-באר (MEA). (A) סכמטי של ההתקנה עבור נוירומודולציה FUS עם MEA רב-באר. הגלים האקוסטיים הנוצרים על ידי מתמר FUS מתפשטים דרך חרוט FUS מלא במים נטולי גז ומצומדים באמצעות ג'ל אולטרסאונד. הפרפילם מאובטח לבאר באמצעות גומייה למניעת זיהום. לוחית MEA שולחת הקלטות חשמליות מתאי העצב למערכת MEA. (B) תצלום של מתמר FUS על הלוח הרב-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מערכת MEA	Axion Biosystem Inc.	מאסטרו אדג'	קצב דגימה: 11500 הרץ
צלחת MEA	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	אלקטרודה ובאר: 16 אלקטרודות ב-24 בארות
ובכן ממשק צלחת	אמקור בע"מ	Parafilm PM996; P7793	עובי: 127 מיקרומטר
מיכל CO2 וסת לתרבות	AirGas Inc. / האריס בע"מ	9296NC	ריכוז: 5%
מדיה תרבותית	ThermoFisher בע"מ	למינין; 23017-015	ריכוז: 1 מיקרוגרם/מ"ל
תאי עצב HiPSC	פפרוטק	CIPS ו GM01582 נגזרו; 450-10	ריכוז: 10 ng/mL (ראו Taga et al [2021]13)
מתמר	סוניק קונספטס בע"מ	CTX250; 008	תדר מרכז: 250 קילוהרץ
רשת תואמת	סוניק קונספטס בע"מ	CTX250; NFS102v2	עכבה: 50 Ω
תפוקת כוח מתמר (TPO)	סוניק קונספטס בע"מ	גרסה 4.1; 020	תדר: מ 250 kHz עד 2.5 MHz
קרום	מקמאסטר בע"מ	גומי סיליקון; 5542N115	עובי: 0.0127 ס"מ
ג'ל צימוד	מעבדת פארקר בע"מ	אקווסוניק 100; B08DDWG GXB	צמיגות: 130,000–185,000 שוטרים
חיבור לבעל בדיקה	מקמאסטר בע"מ	לגנוב מוט מושחל; 90322A661	אורך: 1–1/2 אינץ' אורך
הידרופון	סוניק קונספטס בע"מ	Y-104; 009	טווח: 50 קילו-הרץ – 1.9 מגה-הרץ
מיכל מים	סוניק קונספטס בע"מ	WT	גודל: 30 ס"מ x 30 ס"מ x 30 ס"מ
יחידת מיזוג מים	סוניק קונספטס בע"מ	WCU; SN006	מהירות זרימה: 50 מ"ל/שנייה לכל היותר
אוסצילוסקופ	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	קצב דגימה: עד 50 MHz
במה	סוניק קונספטס בע"מ	מיקרוסטייג'; 2	דיוק: 1 מיקרומטר
יריעה תרמוכרומית	TIPTEMP בע"מ	גיליון גביש נוזלי; TLCSEN337	טווח: 22–24 °C
מחשב	Microsoft Surface	Surface Pro	מעבד i5 1035G4: 3.7 ג'יגה הרץ
תוכנה להעברת נתונים	Mathworks בע"מ	MATLAB	גרסה 2021b
תוכנת עיבוד	Python Software Foundation	פיתון	גרסה 3.7.10