1. הגדרה לפני הקלטות
- הכינו את תמיסות ההקלטה עם ריכוזי יונים כמצוין בטבלה 1.
- הכן 15 מ"ל של 2 M תמיסות מלאי במים טהורים במיוחד עבור MgCl2, CaCl2, KCl ו- CsCl.
- שקלו את הרכיבים המוצקים עבור 100 מ"ל של התמיסות התוך-תאיות ו-500 מ"ל של תמיסות האגירה החוץ תאיות לפי טבלה 1 לכוסות נפרדות והוסיפו את הכמות המתאימה של תמיסות המלאי שהוכנו לאחר מכן. לדוגמה, עבור המאגר התוך-תאי, השתמש ב- 0.3803 גרם (10 mM) EGTA (אתילן גליקול חומצה טטראצטית), 0.2383 גרם (10 mM) HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) ו- 0.6428 גרם (110 mM) NaCl והוסף 100 μL של 2 M MgCl2 ו- CaCl2 ו- 50 μL של 2 M KCl ו- CsCl תמיסות מניות.
- מוסיפים מים אולטרה-טהורים ומתאימים בזהירות את רמת החומציות באמצעות חומצות ובסיסים, שאינם מפריעים למדידה, כלומר אינם מבוצעים על ידי ChR (Channelrhodopsins), כגון חומצת לימון ו-N-מתיל-D-גלואמין (NMG+).
- התאם את האוסמולריות ל- 290 mOsm עבור התוך-תאי ול- 320 mOsm עבור התמיסות החוץ תאיות עם גלוקוז.
הערה: פתרונות תוך תאיים היפואוסמוטיים מעט מגדילים את שיעור ההצלחה של טלאים.
- מסנן סטרילי את כל התמיסות דרך מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן תמיסות בטמפרטורה של 4°C למשך שבועיים או להקפיא בטמפרטורה של -20°C לאחסון לטווח ארוך.
- חישוב פוטנציאלים של צומת נוזלים והכן פרוטוקולי הקלטה.
הערה: שינוי ריכוז כלוריד חוץ-תאי לאחר קביעת תצורה של תאים שלמים גורם לפוטנציאל צומת נוזלי משמעותי (LJP) שיש לתקן. LJPs ניתן למדוד או לחשב ישירות, כאן, האפשרות השנייה משמש. בפרוטוקול זה ייעשה שימוש בתיקון מקוון, הדורש פרוטוקול הקלטה אחד לכל מאגר חיצוני. עם זאת, עבור קבוצה גדולה יותר של פתרונות חיצוניים, מומלץ לאחר תיקון של LJP כדי למנוע תיקון שווא.
- פתח את מחשבון פוטנציאל הצומת (JPC) ופתח את דיאלוג 'הניסוי החדש'. לאחר מכן בחר "מדידות מהדק תיקון". בחר "מדידות תא שלם" ו"אלקטרודת תמיסת מלח סטנדרטית" והזן טמפרטורה של 25 ° C. בין כל שלב, עבור קדימה על ידי קבלת הבחירה על ידי לחיצה על כפתור "הבא".
הערה: הניסויים מבוצעים בטמפרטורת חדר של 25 °C (75 °F) במעבדה ממוזגת. ודא שלפתרונות החיץ יש טמפרטורת חדר לפני תחילת הניסויים. כדי לשנות את טמפרטורת הדגימה ניתן להשתמש בשלב הדגירה או בתא. ניתן למדוד את טמפרטורת האמבטיה לעתים קרובות באמצעות מדחום.
- הוסף את כל ריכוזי האניון והקטיון הבודדים של תמיסת הפיפט ואת חיץ הכלוריד הגבוה בהתאם לריכוזים המפורטים בטבלה 1.
הערה: JPC יחשב LJP של -0.5 mV עבור תנאי ההתחלה.
- לחץ על "תמיסת אמבטיה חדשה" כדי להזין את ההרכב האניוני והקטיוני של מאגר הכלוריד הנמוך.
הערה: JPC יחשב כעת LJP חדש של +12.6 mV בהתאם לפתרון ההקלטה החוץ תאי שהשתנה.
- הכן שני פרוטוקולים מתוקנים של LJP עבור שני תנאי המדידה על-ידי הפחתת ה- LJP המחושב מפוטנציאל ההחזקה המוחל; -0.5 mV עבור הגבוה ו- +12.6 mV עבור התמיסות החיצוניות עם כלוריד נמוך. לפיכך, הפרוטוקולים מתחילים עם -79.5 mV (כלוריד גבוה) ו -92.6 mV (כלוריד נמוך), בהתאמה כדי לקבל פוטנציאל החזקה התחלתי מתוקן LJP של -80 mV בשני המקרים.
הערה: השלבים הבאים חלים על תוכנת רכישת הנתונים המוזכרת ברשימת החומרים.
- פתח את עורך הפרוטוקולים בתוכנת הרכישה. מתפריט "מצב", בחר "גירוי אפיזודי" וכלול 7 טאטואים.
- עבור לתפריט "צורת גל" בעורך וכלול תקופה של 200 מילישניות עם פוטנציאל החזקה של 0 mV ואחריה תקופה של 2 שניות עם פוטנציאל החזקה משתנה החל מ- -79.5 mV עבור כלוריד גבוה. כלול "רמת דלתא" של 20 mV לתקופה השנייה כדי להגדיל את פוטנציאל ההחזקה ב -20 mV בכל טאטוא.
- במסגרת שלבי המתח של עורך צורת הגל, החל תקופת הארה של 500 אלפיות השנייה עם אור של 540 ננומטר (3.10 mW/mm²). לשם כך, שנה את "תבנית הסיביות הדיגיטלית" של התריס המחובר השולט במקור האור כך שיהיה פעיל 500 אלפיות השנייה לאחר התקופה השנייה המתוארת לעיל (ראה 1.2.6).
הערה: עוצמת האור יכולה להשפיע על תכונות ביופיזיקליות של זרמי ערוץ כמו משרעת או אי-הפעלה. לכן, תמיד יש לדווח על צפיפויות עוצמת אור. כדי למדוד את עוצמת האור לאחר מעבר דרך כל האופטיקה והכיסוי, השתמש באופטומטר מכויל. כדי לחשב את צפיפות ההספק, קבע את השדה המואר של המטרה במיקרומטר אובייקט וחלק את עוצמת האור הנמדדת בשדה המואר שנקבע.
- שמור את הפרוטוקול לתמיסה חוץ-תאית עתירת כלוריד. שנה את הפרוטוקול והחלף את פוטנציאל ההחזקה ברמה הראשונה ב- -92.6 mV (כלוריד חיצוני נמוך). שמור פרוטוקול שני זה כדי למדוד את המצב החוץ-תאי הנמוך של כלוריד.
- ציפוי ליזין של כיסויי זכוכית לפי פרוטוקול מותאם.
- מניחים מספר פתקי כיסוי של 100 בצלחת פטרי זכוכית ומוסיפים 250 מ"ל HCl (1 N).
- מניחים את צלחת הפטרי עם החלקות הכיסוי על שייקר ליניארי. יש לנער במהירות 120 סל"ד במשך 72 שעות כדי לנקות את הכיסויים, ולאחר מכן לשטוף במים טהורים במיוחד כדי לנטרל את רמת החומציות.
- השרו אותם בנפח קטן של 95% אתנול לניקוי נוסף.
הערה: ניתן לאחסן פתקי כיסוי נקיים באתנול 70% לפני שתמשיך. עבוד תחת מכסה מנוע זרימה למינרית עבור השלבים הבאים.
- בעזרת מבער בונזן ופינצטה, מבעירים כל מכסה ומעבירים אותו לצלחת פטרי חדשה.
- יש לדגור על כיסויי הזכוכית בתמיסת פולי-D-ליזין סטרילית של 50 מיקרוגרם/מ"ל למשך שעה אחת לפחות (או לילה) בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור עם שייקר ליניארי ב-150 סל"ד.
- שטפו את הכיסויים במים טהורים במיוחד כדי להסיר עודפי פולי-D-ליזין.
- מורחים את החלקות הכיסוי על נייר סטרילי לייבוש למשך 10 דקות, וחושפים אותן לאור אולטרה סגול (UV) לצורך עיקור (לפחות 20 דקות).
- אספו את הכיסויים לצלחת פטרי סטרילית מכוסה ברדיד אלומיניום עד לשימוש.
- הכינו דנ"א של הגן PsACR1 המאוחה ל-mCherry באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות.
- שכפל את רצף הגנים הממוטב לקודון האנושי המקודד PsACR1 לפלסמיד peGFP-C1 (CMV (Cytomegalovirus) פרומוטור, עמידות לקנמיצין) במסגרת עם פלואורופור mCherry באמצעות אנזימי הגבלה או שיטות שיבוט מבוססות אחרות.
הערה: ניתן להשתמש גם בפלואורופורים אחרים, אך יש לוודא שיש את ערכות המסננים המתאימות זמינות כדי לצפות בפלואורסצנטיות שלהם תחת המיקרוסקופ בהתקנה.
- הפוך את ה- DNA של פלסמיד לתאי E. coli XL1Blue כימותרפיים באמצעות שוק חום בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי וצלחת אותם על לוחות אגר (30 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin). לגדל את החיידקים המצופים במשך הלילה ב 37 ° C.
- למחרת, לחסן 4 מ"ל מרק ליזוגני בינוני בתוספת 30 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin עם תאים ממושבות בודדות לדגור אותם לילה ב 37 ° C ו 180 סל"ד באינקובטור.
- לאחר דגירה של לילה, לטהר את DNA פלסמיד מן התרביות באמצעות ערכה זמינה מסחרית על פי הוראות היצרן.
- זרעו את התאים
הערה: בצע שלבים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית.
- הניחו עד שלושה כיסויי זכוכית מצופים ליזין זה לצד זה בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ.
הערה: לחצו אותם בעדינות על תחתית הצלחת כדי למנוע החלקה אחד על השני.
- זרעים 1.5 x 105 HEK (תאי כליות עובריים אנושיים) תאים בתקן 2 מ"ל Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) בכל מנה.
- יש להשלים את all-trans retinal בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. לגדל את התאים לפחות יום אחד לפני שתמשיך עם שלב 1.6.
- Transiected את התאים באופן זמני באמצעות lipofection.
- עבור כל צלחת של תאים, להכין פתרון של 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (חומצה Deoxyribonucleic) ב 250 μL DMEM ללא FBS ו 6 μL מגיב transfection.
- לאחר 15 דקות של דגירה, בעדינות (טיפתית) להוסיף את הפתרון לתאים.
- הכנת גשרי אגר
- מוסיפים 0.75 גרם אגרוז לתמיסת נתרן כלורי סטרילית של 50 מ"ל (140 מ"ל) וממיסים אותה על ידי חימום במיקרוגל.
הערה: 2 - 3 M KCl להכנת גשר אגר מפחית עוד יותר את LJP עקב ריכוז גבוה יותר (למשל דיפוזיה קבועה מהגשר) וניידות שווה של K+ ו- Cl- יונים, אך נמנע למזער דליפת יונים (במיוחד Cl-) לתמיסת האמבטיה.
- מלא 10 קצות פיפטה μL (או צינור בקוטר קטן) בתמיסת אגרוז נוזלית באמצעות מזרק.
הערה: הימנעו מבועות אוויר בגשר.
- לאחר שגשרי האגר התקררו והתמצקו, אחסנו אותם בתמיסת נתרן כלורי סטרילית של 140 מילימול.
- הכינו אלקטרודות הקלטה ואמבטיה.
- הסר חוטי כסף מהאמבטיה ואלקטרודת ההקלטה של מערך מהדק המדבקות.
- לטש את החוטים עם נייר זכוכית כדי להסיר כלוריד כסף מניסויים קודמים. טבלו את חוט הכסף הנקי ב- 3 M KCl וחברו אותו לקוטב החיובי של סוללת 1.5 V לציפוי אלקטרוליטי בכלוריד כסף.
הערה: ניתן להשתמש בספק כוח מעבדה במקום בסוללה.
- משוך פיפטות טלאי בעלות התנגדות נמוכה (1.5-3.0 MΩ) מנימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה ומלטש אותן באש. יש לאחסן פיפטות ללא אבק ליום המדידה.
- הפעל את כל רכיבי ההתקנה כדי להתחמם לטמפרטורת עבודה 30 דקות לפני ההקלטות. ודא שהמאגרים נמצאים בטמפרטורת החדר.
2. מדידות סלקטיביות
- התחל את ההקלטות 24 עד 48 שעות לאחר טרנספקציה חולפת של התאים.
- הניחו מכסה אחד בתא המדידה ואטמו אותו בסיליקון כדי למנוע דליפה של החיץ החיצוני. אחסנו את צלחת הפטרי עם שאר הכיסויים באינקובטור לסדרת הניסויים הבאה.
- מלא בזהירות את התא במאגר חוץ-תאי (גבוה [Cl-]) כדי למנוע ניתוק תאים, ואז מקם אותו מתחת למיקרוסקופ והשתמש במטרה 40X כדי לדמיין תאים.
- הניחו גשר אגר מעל אלקטרודת האמבטיה והכניסו אותו לתא יחד עם חיישן מפלס הנוזל ויציאת הזילוח של מטפל האמבטיה.
- החליפו את התמיסה החוץ-תאית פעמיים ב-1 מ"ל של תמיסה חיצונית טרייה (גבוהה [Cl-]) כדי להסיר תאים מדיום תרבית שיורית ותאים מנותקים.
- הביאו את התאים למיקוד וחפשו תא נגוע (פלואורסצנטי), שצריך לבודד מתאים אחרים. השתמש בערכת מסננים בעלת שלושה תחומי תדרים ואור כתום (590 ננומטר; רוחב פס 15 ננומטר; עוצמה של 100%) כדי להלהיב ולדמיין mCherry.
הערה: תאי HEK יכולים להיות מצומדים חשמלית לשכניהם על ידי צמתים מרווחים וכתוצאה מכך התנגדות נמוכה לממברנה בתצורת התא כולו.
- מלאו את אחת הפיפטות שנמשכו בתמיסה תוך תאית והסירו בועות אוויר על ידי הפיכת הפיפטה מספר פעמים.
- הרכיבו את הפיפטה על מחזיק הפיפטה והפעילו לחץ חיובי כדי למנוע סתימה של הקצה.
- אתר את קצה פיפטת המדבקה מתחת למיקרוסקופ ונווט אותה קרוב לתא באמצעות המיקרומניפולטור.
הערה: השלבים הבאים חלים על המגבר, תוכנת איסוף הנתונים וההערכה המוזכרת ברשימת החומרים.
- התחל את "בדיקת הממברנה" בתוכנת רכישת הנתונים והחל שלב מתח (דופק בדיקה; לדוגמה, 5 mV עבור 10 אלפיות השנייה, בסיס של 0 mV), באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנה מוגדרת באמצעות "מצב אמבטיה" בעת הפעלת "בדיקת ממברנה" בתוכנת רכישת הנתונים.
- בדוק כי התנגדות פיפטה היא בטווח הרצוי (1.5-3.0 MΩ).
- אפס זרמי היסט על ידי התאמת פוטנציאל פיפטה על ידי סיבוב ידית היסט פיפטה במגבר תוך כדי עבודה ב"מצב אמבטיה" של "בדיקת הממברנה".
- יצירת תיקון בתצורת התא כולו.
הערה: השלבים הבאים דורשים הפעלת לחץ חיובי ושלילי המועבר ליציאה הצדדית של מחזיק פיפטה משומשת. זה יכול להיעשות באמצעות מזרק, באמצעות חתיכת פה או וסת לחץ נשלט אלקטרונית. בפרוטוקול זה מופעל לחץ חיובי ושלילי באמצעות חתיכת פה.
- התקרבו לאט לתא עם פיפטת המדבקה מלמעלה ושחררו את הלחץ החיובי ממש לפני שנוגעים בו.
הערה: כאשר הקצה קרוב לתא, ההתנגדות תעלה מעט; זה מסומן על ידי גודל מופחת של דופק הבדיקה.
- שנו את "מבחן הממברנה" מ"מצב אמבטיה" ל"מצב תיקון" ובכך את פוטנציאל ההחזקה לפוטנציאל המנוחה הצפוי של התאים (-30 עד -40 mV).
- במקרים מסוימים התצורה המחוברת לתא יוצרת את עצמה לאחר שחרור הלחץ החיובי. אם לא, הפעילו בעדינות לחץ שלילי כדי לסייע להיווצרות gigaseal.
הערה: תצורה המחוברת לתא נקבעת כאשר דופק הבדיקה מצטמצם לשתי פסגות קיבוליות קטנות בתחילת הדופק ובסופו, והתנגדות הממברנה נמצאת בטווח GΩ; מתחים שליליים של עד -60 mV עשויים להקל על היווצרות gigaseal.
- פצה את קיבול פיפטה על ידי סיבוב ידיות "פיצוי קיבול פיפטה" כדי לקבל תגובה שטוחה של דופק הבדיקה.
- קרע את המדבקה מבלי להרוס את החותם על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי או לחץ שלילי עם כוח הולך וגובר, כדי להשיג קונפורמציה של התא כולו.
הערה: מעבר מוצלח מתצורת התא המחובר לתצורת התא כולו מסומן על ידי עלייה של הפסגות הקיבוליות.
- החל פיצוי התנגדות סדרתי על ידי הגדרת פרמטר תא שלם והתאמות פיצוי של המגבר המשומש להידוק מדויק של פוטנציאל הממברנה למתח האחיזה הרצוי.
- העבר את "בדיקת הממברנה" למצב "תא שלם", בלוח "פיצוי התנגדות סדרתי" הפעל "חיזוי" ו"תיקון" עד 90% הימנעות מצילומי יתר ותנודות של התגובה הקיבולית, הפעל את מתג הפיצוי של התא כולו והתאם פרמטרים של תא שלם עם הידיות המתאימות בלוח הקדמי ("קיבולת תא שלם" ו"התנגדות סדרתית") של המגבר באופן איטרטיבי כדי להשיג באופן אידיאלי תגובת חותם בדיקה שטוחה.
הערה: לתיאור מפורט של פיצוי ותיקון התנגדות סדרתית, עיין במדריך או בהנחיה של המגבר, שכן הליך זה משתנה בין יצרנים שונים.
- לאחר קביעת תצורת התא כולו, המתן לפחות 2 דקות לפני ההקלטה כדי להבטיח החלפה מספקת של תמיסה תוך תאית דרך פיפטת התיקון.
- הקלט זרמים המושרים על ידי אור בפוטנציאלי החזקה שונים באמצעות הפרוטוקולים שהוגדרו בעבר (ב-1.2).
- החליפו את המאגר החוץ-תאי ל-[Cl-] נמוך בתא לפחות חמש פעמים מבלי להרוס את המדבקה ורשמו יחס זרם-מתח נוסף (cf. step 1.2) בריכוז הכלוריד החדש.
הערה: מערכת זילוח להחלפת מאגר אוטומטית מאפשרת תהליך זה אך אינה הכרחית.
- חזור על 2.15. עבור כל מצב יוני להיבדק, אך בדוק שוב ושוב את איכות המדבקה בין המדידות על ידי "בדיקת ממברנה" שתוארה לעיל.
הערה: כדי להבטיח מתח מדויק של הממברנה והרכב יונים תוך-תאי יציב, התנגדות הממברנה צריכה להיות מעל 500 MΩ ואילו התנגדות הגישה לא צריכה לעלות על 10 MΩ, ראה. 2.12.6). אל תשכח לכבות את פיצוי הפרמטר של התא כולו עבור בדיקת הממברנה.
- חזור על 2.2. עד 2.15. עבור מספר תאים, אך קח פתק כיסוי חדש עבור כל סדרת בדיקות כדי להבטיח את בריאות התאים.
טבלה 1: הרכב יוני של פתרונות חוצצים. הרכב מאגרים תוך-תאיים (תוך-תאיים) וחוץ-תאיים (נוספים) לניסויי סלקטיביות כלוריד בתאי HEK. קיצורים בשימוש: אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) ו aspartate (ASP). כל הריכוזים הם mM.
| תוך כדי | תוספת.1 | תוספת.2 |
| כלוריד גבוה | דל כלוריד | דל כלוריד |
| ג [mM] | ג [mM] | ג [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| אוסמולריות | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
