הקלטות מהדק טלאי מחורר של גופי תאי עצב חושיים באוזן הפנימית

תקציר

מקור: Iyer, M. R., et al. בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים בילודים להקלטות טלאי-מהדק. J. Vis. Exp. (2023).

סרטון זה מדגים את טכניקת מהדק המדבקה למדידת זרמים יוניים בגופי תאי נוירון חושיים באוזן הפנימית. הוא מפרט את ההכנה והשימוש בפיפטת מהדק טלאי מלוטשת מלאה בתמיסה פנימית המכילה אמפוטריצין B, המנקב את הממברנה כדי לאפשר תנועת יונים תוך שמירה על התנאים התוך-תאיים. פולסי מתח מופעלים כדי להפעיל ולתעד את פעילות תעלת היונים, ומספקים תובנות לגבי תכונותיהם והתנהגותם.

פרוטוקול

1. הקלטה

הערה: בהליך זה, הקלטות מהדק טלאי מהגנגליון המבודד מבוצעות בדרך כלל 12-24 שעות לאחר הציפוי. מעבדות אחרות דיווחו על תוצאות של תאי עצב לאחר תקופות ארוכות הרבה יותר בתרבית.

1. הכנת תא ההקלטה
   1. השתמש בתא ההקלטה להחלפה מהירה (או שווה ערך) המאפשר הקלטות מהדק טלאים ישירות בצלחת התרבית. הגדר את החדר על המיקרוסקופ ההפוך.
   2. הכניסו את צלחות התרבית בעלות תחתית הזכוכית לתוך התא.
   3. הזינו את תמיסת L-15 דרך מערכת צינורות זילוח לתא ההקלטה. לייצב את הזלוף פנימה זרימה החוצה בתא בקצב של 0.5-1 מ"ל לדקה.
2. הכנת הפתרון הפנימי לטעינת אלקטרודות
   1. הפשירו אליציטוט של התמיסה הפנימית המחוררת. הקצו 2.5 מ"ל של התמיסה לצלחת תרבית של 35 מ"מ. החליפו את המכסה על מנת התרבית ותייגו כ"מטבל טיפ". הניחו בצד באזור ללא אבק, מכיוון שחשוב מאוד לשמור על פתרון זה נקי ככל האפשר.
   2. שקול 1 מ"ג של amphotericin-B ולהוסיף 20 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO). מערבלים ומסובבים את התמיסה עד שכל האמפוטריצין-B נמצא בתמיסה. הוסף 10 μL של תמיסת DMSO/amphotericin-B ל-2 מ"ל הנותרים של התמיסה הפנימית המחוררת המופשרת. משכו ופזרו את התמיסה עם פיפטה פעמיים או שלוש כדי לוודא שה-DMSO/אמפוטריצין-B התערבב באופן אחיד בתמיסה הפנימית. הפתרון יהיה גוון צהבהב קל.
   3. ציירו את התמיסה הפנימית המחוררת של אמפוטריצין-B לתוך מזרק של 3 מ"ל. מוסיפים קצה של 34 גרם למזרק. עוטפים את המזרק ברדיד אלומיניום ושומרים את המזרק על קרח.
      הערה: תמיסה זו חייבת להיות מחדש כל 2 שעות כדי להבטיח את היעילות של amphotericin-B בניקוב קרום התא. Amphotericin-B הוא רגיש לאור, והוא חייב להיות מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום או שיטות אחרות.
3. הקלטות מהדק טלאי
   1. דמיינו את תאי העצב באמצעות מטרה של 10x או 20x. כוונן את התאורה ומטב את האופטיקה כדי לראות את הגבולות והצללים סביב התא.
   2. בדוק את איכות הנוירונים המבודדים. נסו רק תאי עצב עם משטחים חלקים ואחידים שאינם מנוגדים חזק מדי ויש להם רק מכתשים קטנים ומפוזרים. כמו כן, הקפידו להימנע מזוגות של נוירונים, תאי עצב המוקפים בפסולת או תאים אחרים.
   3. תחת הגדלה של פי 100, זהו תא עצב או שדה של תאי עצב כדי לתקן אותם ולסדר אותם במרכז שדה הראייה.
   4. ממלאים את קצה הפיפטה בתמיסה נקייה שאינה מכילה אמפוטריצין על ידי טבילת הקצה (במשך ~20 שניות) בתמיסה הנקייה שהונחה בצלחת תרבית. פעולה נימית תמשוך כמות קטנה של תמיסה לתוך הקצה.
      הערה: בצע שלב זה תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני, המאפשר לקבוע עד כמה הקצה מחזיק את תמיסת Tip Dip. אם התמיסה אינה מחזיקה ~ 10-20 שניות, צורת האלקטרודה אינה אידיאלית. במקרה זה, הגדר מחדש את תוכנית משיכת האלקטרודות כדי להפיק קצה ארוך יותר.
   5. לאחר מכן, למלא את החלק האחורי של פיפטה עם פתרון פנימי המכיל amphotericin. חוט הלהט בתוך פיפטה ימשוך למטה את התמיסה כדי לפגוש את הפתרון הנקי בקצה. אפשרו לחוט הלהט למשוך את התמיסה בצורה חלקה כלפי מטה, ואל תנסו להקיש על בועות, מכיוון שזה יאלץ את האמפוטריצין לקצה מהר מדי.
   6. השתמש מזרק כדי לשלוף תמיסה שעשויה להיות בחלק האחורי של האלקטרודה.
      הערה: חשוב מאוד לעבוד מהר מנקודה זו ליבשה וליצור אטם בעל עמידות גבוהה על התא הרצוי.
   7. הכנס את פיפטה לתוך מחזיק פיפטה. בדקו שהפיפטה צמודה למחזיק כדי למנוע סחף פיפטה. אם הפיפטה אינה יציבה, כבו את טבעות ה-O האוטמות בחלק הקדמי והאחורי של מחזיק הפיפטה, כדי למזער סחף ולשמור על יניקה חזקה. החליפו את פיפטה עם אחד כי הוא מלא טרי.
   8. הורידו את הפיפטה לאמבטיה של תא ההקלטה.
   9. אתר את קצה פיפטה באמצע שדה הראייה. ודאו שהקצה נקי מבועות אוויר או פסולת אחרת.
   10. החל שלב מתח (5 mV) בבדיקת הממברנה כדי לפקח על התנגדות פיפטה. המשך לעקוב אחר התנגדות הקלט לאורך כל התהליך של יצירת חותם על התא.
   11. בטל את פוטנציאל היסט הפיפטה, כך שזרם פיפטה קורא אפס במצב בדיקת הממברנה של pClamp.
   12. נכון עבור קיבול פיפטה באמצעות פונקציית פיצוי הקיבול המהיר במגבר מהדק התיקון (חוגות מהירות Cp בלוח הרך Multiclamp Commander).
   13. העבר את פיפטה למטה לתא.
   14. ברגע שהפיפטה קרובה מספיק לתא העצב, עברו למטרת ההגדלה הגבוהה יותר ושלחו את התמונה דרך מצלמה למוניטור (השתמשו במטרה של פי 40, הגדלה כוללת של פי 400). התאימו את פיפטה ומרכזו מחדש את תא העצב.
   15. הזז את אלקטרודת ההקלטה קרוב לסומה. אתר את מרכז תא העצב על הצג ומקם את אלקטרודת ההקלטה מעל תא העצב.
   16. התקרבו לתא העצב מלמעלה, כך שהאלקטרודה תנחת במרכז התא הכדורי. כוונן את היסט פיפטה לאפס את פוטנציאלי DC הקבועים במערכת.
   17. מקם את פיפטה קרוב לממברנה. קרקע יציבה במרכז התא.
       הערה: בעת הנחיתה, תתרחש שקיעה קטנה על פני השטח של תא העצב והכפלה/שילוש של התנגדות הקלט.
   18. יש להפעיל לחץ שלילי (יניקה) באמצעות מזרק או פיפטה בפה. הפעל את פוטנציאל ההחזקה של -60 mV. התנגדות האטם אמורה לגדול עד שהוא עובר ג'יגה-אוהם.
       הערה: עבוד במהירות כדי להפחית את הזמן בין מילוי אלקטרודה לנחיתה על תא. יש זמן מוגבל לפני שהאמפוטריצין שנוסף לתמיסה הפנימית המחוררת מגיע לקצה האלקטרודה. ברגע שהקצה מזוהם באמפוטריצין, קשה ליצור אטמים בעלי עמידות גבוהה, וההתנגדות לעיתים קרובות מתיישבת ל~200 מגה-אוהם.
   19. ברגע שנוצר חותם ג'יגה-אוהם, שחררו את הלחץ השלילי. ברגע שהחותם נוצר, החל פיצוי קיבוליות מהיר כדי להפחית את המשרעת של מעברי הקיבול פיפטה במצב בדיקת קרום ככל האפשר.
   20. כאשר האמפוטריצין מתחיל לעבוד, שימו לב כיצד התנגדות הכניסה פוחתת לאט והזרם הזורם בתגובה לשלב המתח של 5 mV גדל בהדרגה כאשר האמפוטריצין נכנס לממברנה. ירידה פתאומית בהתנגדות הסדרה במקום התייצבות הדרגתית מצביעה על כך שהתרחש קרע ספונטני.
   21. הערך את הקיבול של התא כולו ואת התנגדות הסדרה באמצעות פונקציית הביטול הארעי הקיבולי של המגבר. תעד ונטר את עמידות הסדרה בתחילת הניסוי ובמהלכו באופן קבוע.
       הערה: התנגדות הסדרה יכולה להימשך בין 5-20 דקות לייצוב, תלוי בגודל האלקטרודה וכמה תמיסה נקייה נשאבת לתוך הפיפטה. ניתן להשתמש במצבי מהדק מתח ומהדק זרם לאחר שהתנגדות הסדרה התייצבה מתחת ל- 30 מגה-אוהם. נפיחות או התכווצות של הנוירונים במהלך ההקלטה נצפית לפעמים, אך לעתים רחוקות כאשר האוסמולריות וה- pH של הפתרונות מותאמים כראוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמפוטריצין	סיגמא-אולדריץ'	A4888-100 מ"ג	להקלטות טלאים מחוררות.
ATP די-נתרן	סיגמא-אולדריץ'	A7699	תוסף לפתרון פנימי
CaCl2	ג'יי טי בייקר	1311-01	תוסף לפתרון פנימי
DMSO	ביוטיום	90082
EGTA	סיגמא-אולדריץ'	E0396	תוסף לפתרון פנימי
מושך אלקטרודות	נרשיגה	PC-10
אתנול	מעבדות דקון	2716	לניקוי ראש וסביב ספסל דיסקציה
נימי בורוסיליקט נימיים לאלקטרודות	סאטר אינסטרומנטס	BF140-117-10
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375-100G	לאגירה ברמת החומציות של כל הפתרונות בפרוטוקול
פלטה חמה / בוחשנים מגנטיים	VWR	76549-914
K2SO4, אשלגן גופרתי	סיגמא אולדריץ'	P9458-250G	תוסף לפתרון פנימי
KCl	סיגמא-אולדריץ'	P93333	תוסף לפתרון פנימי
קו (1 מטר)	האניוול	319376-500 מ"ל	להביא פתרון פנימי לרמת החומציות הרצויה.
תא הקלטה עם אמבטיה בפרופיל נמוך לצלחות תרבות	וורנר אינסטרומנטס	64-0236
MgCl 2-הקסהידראט	סיגמא-אולדריץ'	M1028	תוסף לפתרון פנימי
מחט microFil למילוי micropipettes - 34 מד	מכשירים מדויקים בעולם	MF34G
מיקרופורג'	נרשיגה	MF-90	לליטוש אלקטרודות.
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S7653	תוסף לפתרון פנימי
NaOH (1 מטר)	תומאס סיינטיפיק	319511-500 מ"ל	עבור pH טיטרציה
חמצן, דרגה רפואית, עם וסת וצינורות נאותים	ניהול חומרים של USC	MEDOX200 (מזהה: 00015)	להתמוססות לתמיסות דיסקציה ואמבטיה
פולי-די-ליזין מצופה זכוכית תחתונה מנה תרבותית	מאטק	P35GC-0-10-C	כדי לצלחת נוירונים לתרבית
מסנני ממברנות PES , 0.2 מיקרומטר	נלג'ין	566-0020	לפתרונות סינון
מסנני מזרק סטרילי קרום PES, 0.22 אום, 30 מ"מ	CELLTREAT	229747	לתמיסות סינון שנמשכו למזרקים
מד pH	מטלר טולדו	דגם S20
תא הפניה	מכשירים מדויקים בעולם	RC1T
קנה מידה מדעי	מטלר טולדו	XS64
צלוחיות נפחיות, 1000 מיליליטר
מים, סטרילי u ltrapure, R>18.18 מגה-Ohms ס"מ (למשל, מסונן על ידי מערכת טיהור מים Millipore-Sigma)	מיליפור-סיגמא	CDUFBI001