כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת אלקטרודות (איור 1A-C)
הערה: מיקומי סיכות מחשב הם פשוט מגע בולט כחלק מממשק אותות בהתקני תקשורת. הוא מורכב ממחבר זכר המתחבר למחבר הנקבה.
- הפרידו בזהירות את הסיכות הזכריות והנקביות ממיקומי סיכות המחשב (איור 1A) בעזרת צבת. חברו את הפינים של הזכר והנקבה יחד כדי ליצור אלקטרודה והפעילו ציאנואקרילט כדי ליצור קשר דבק חזק (איור 1C).
- הכניסו את האלקטרודות לכוס מלאה במים מזוקקים והעבירו אותן לחומר ניקוי על-קולי למשך 10 דקות. העבירו אותן לתנור ייבוש בטמפרטורה של 45°C למשך 30 דקות. עקרו את האלקטרודות באמצעות אור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
2. הליך כירורגי (איור 1D-F)
- הכינו את כלי הניתוח המעוקרים ואת המנגנון הסטריאוטקסי. מרדימים את גור החולדות היילוד באמצעות הרדמה איזופלורנית (2.5%) עם אוויר. כאשר הגור מורדם עמוק, להתאים את המינון של isoflurane ל 1.0%. בצע צביטת זנב או בוהן לפני הניתוח כדי להבטיח עומק הרדמה תקין.
- קבע את ראש הגור במנגנון הסטריאוטקסי על ידי הכנסת מוטות האוזניים לתעלות האוזן והידוק קל שלהן.
הערה: אין להדק יתר על המידה את מוטות האוזניים, מכיוון שגולגולת היילוד רכה מאוד.
- שמור על שדה כירורגי סטרילי על ידי ריסוס כל הציוד עם 70% אתנול. בצע חתך של 15 מ"מ בראש באמצעות אזמל. בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את הקרקפת מקו האמצע בארבע הפינות. שימו מעט כותנה ספוגה במי מלח מתחת לעור כדי לשמור על החתך פתוח לרווחה (איור 1D).
- מצא את נקודות bregma ו lambda על הגולגולת ולסמן אותם עם עיפרון. השתמש במחט מזרק (26 G) כדי ליצור שני חורי בור בקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) ובהיפוקמפוס.
הערה: ה-PFC ממוקם ב-+1.8 מ"מ אחורי לברגמה ו-0.5- מ"מ רוחבי לקו האמצע, בעוד שההיפוקמפוס ממוקם ב-2.0- מ"מ קדמי לברגמה ו-±0.5 מ"מ רוחבי לקו האמצע (איור 1D ו-E). עומק האלקטרודה לא צריך להיות יותר מ 2 מ"מ מתחת לפני השטח קליפת המוח כדי למזער נזק מוחי.
- השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את האלקטרודות והכניסו את אלקטרודות הייחוס וההקלטה ל-PFC ולהיפוקמפוס, בהתאמה. החל משחה אריתרומיצין סביב האלקטרודה כדי למנוע כל זיהום אפשרי. תקן את האלקטרודה באמצעות cyanoacrylate.
- הכינו מלט אקרילי דנטלי כך שיהיה לו עקביות דביקה וצמיגה. החל את מלט השיניים כדי לכסות את האלקטרודות ואת שאר הגולגולת.
הערה: יבש היטב את הגולגולת לפני החלת מלט השיניים.
- יש למרוח 5% חומצה פיקרית על האלקטרודות כדי להגן עליהן.
הערה: ההליך כולו צריך להיעשות במכסה מנוע בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים סטריליים.
- הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והזריק 300 μL של 10% גלוקוז תת עורית. הניחו אותו על שמיכה מחוממת להתאוששות. ודא כי בעל החיים הוא חם (37 ° C) ו אמבולטורי (כלומר, התאושש לחלוטין). מתן buprenorphine intraperitoneally (0.05 מ"ג / ק"ג) עבור כאב לאחר הניתוח.
הערה: אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת (כלומר התנהגות ותנועה נורמליות).
- החזירו את הגור לכלוב הביתי שלו עם הסכר שלהם לאחר שהוא חוזר להכרה. המתן יומיים עד שהחיה מתאוששת לחלוטין.
3. הקלטת EEG
- לאחר החלמה מלאה, חברו את האלקטרודות שהושתלו על גולגולת הגור למגבר בכלוב משלו. חבר את המגבר לממיר אנלוגי לדיגיטלי וחבר את הממיר למחשב; יש להתייחס בזהירות לקווים המחברים כדי שלא יסתבכו.
- בחר קצב דגימה של 10,000 הרץ לפחות ביחידת איסוף הנתונים להקלטה (רוחב הפס של המשדר הוא 1-100 הרץ). ודא שהנתונים נדגמו כראוי.
- לאחר קבלת ההקלטה הבסיסית, הזריקו לגור חומצה קאינית (KA, 2 מ"ג/ק"ג) כדי לגרום להתקפים אפילפטיים. 15 דקות לאחר זריקת KA להתבונן ולתעד את ההפרשות האפילפטיות. ההתקפים הנוצרים באמצעות KA הם בדרך כלל פיזיים.
הערה: משך האיקטל-טוניק הוא כ-15.2 ±0.9 שניות, משך ההתקף הוא כ-62±5 שניות. ניתן למנוע התקפים בחולדה בילוד על ידי מתן הזרקת IP של הידרט כלורלי (400 מ"ג/ק"ג).
- שמור את הנתונים הדיגיטליים ונתח אותם באמצעות חבילות תוכנה לעיבוד אותות, כגון spike2. חשוף את רמת העוצמה של רכיבי תדר שונים באות EEG בילוד על ידי ביצוע ניתוח ספקטרום הספקטרום. חשב את ההספק במסגרת זמן של דקה אחת על ידי מציאת המשרעת הריבועית של ממוצע השורש מ- 1 עד 100 הרץ (פס EEG).
