רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

תקציר

מקור: Qi, G., et al. אפיון אלקטרופיזיולוגי ומורפולוגי של מיקרו-מעגלים עצביים בפרוסות מוח חריפות באמצעות רישומי טלאי זוגיים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את ההליך למיפוי קשרים סינפטיים על ידי אבטחת פרוסת מוח, מיקום פיפטות להשגת תצורות של תאים שלמים, וגירוי נוירונים קדם-סינפטיים להקליט תגובות פוסט-סינפטיות, ובכך להבהיר קישוריות עצבית.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הקלטה זוגית של מהדק טלאי ומילוי ביוציטין

בהתאם לסוג הקשר הסינפטי, שלוש גישות שונות משמשות למציאת נוירונים מצומדים סינפטית. אם הסתברות החיבור נמוכה (כפי שניתן לצפות עבור רוב החיבורים המעוררים), המשך באופן הבא:

1. חיבורים עצביים עם קישוריות נמוכה
   1. מלא את פיפטות התיקון בתמיסה פנימית של ההרכב המפורט בטבלה 1. עבור כל הרישומים בתצורת התא כולו, הוסף ביוציטין בריכוזים בין 3 - 5 מ"ג / מ"ל לתמיסה הפנימית (פיפטה) כדי להשיג תוצאות צביעה טובות עבור נוירונים טרום ופוסט-סינפטיים. תן ביוציטין להתפזר לתוך התא לפחות 15 - 30 דקות (בהתאם לגודל של נוירון).
      הערה: אין להוסיף ביוציטין לתמיסה המשמשת בפיפטות 'חיפוש' המוזכרות להלן.
   2. תקן נוירון פוסט-סינפטי משוער במצב התא כולו. השתמש פיפטות תיקון עם שוק ארוך ודק. זה מקל על יכולת התמרון של פיפטה תחת המטרה ומקטין חפצים התנועה שעלולים להתרחש כאשר האלקטרודה הוא הציג את הפרוסה.
   3. לאחר מכן, תקן נוירון קדם-סינפטי פוטנציאלי בתצורה המחוברת לתא באמצעות פיפטת טלאי 'מחפשת' בעלת התנגדות של 8 - 10 MΩ וקוטר קצה קטן. פיפטות אלה יוצרות טלאי 'רופף' המחובר לתאים. מלאו את פיפטת ה"חיפוש" בתמיסה פנימית שבה K⁺ מוחלף ב-Na⁺ (טבלה 2) כדי למנוע דה-פולריזציה של תאי עצב במהלך חיפוש אחר תא קדם-סינפטי.
      הערה: התנגדות האטם 'רופפת' אינה בתחום GΩ אלא בדרך כלל סביב 30 - 300 MΩ.
   4. החזק את פוטנציאל הממברנה מתחת לאטם 'רופף' לכ- -30 עד -60 mV במצב המהדק הנוכחי. לאחר מכן, הפעל פולסי זרם גדולים (0.2 - 2 nA) כדי לעורר פוטנציאל פעולה בתא הפרה-סינפטי הפוטנציאלי. שימו לב לפוטנציאל פעולה זה כדוקרן קטן על תגובת המתח.
   5. הגדר את תדירות הגירוי ל- 0.1 הרץ כדי למנוע ריצה של תגובה פוסט-סינפטית. השתמש בתדרי גירוי נמוכים יותר אם רקמת המוח מאוד לא בשלה או שהחיבור הסינפטי אינו אמין במיוחד.
   6. במקרה שתא העצב ה"פוסט-סינפטי" אינו מגיב לגירוי של תא העצב ה"קדם-סינפטי" שנבדק, הדביקו תא עצב חדש במצב חותם "רופף". אין להחליף את אלקטרודת המדבקה 'המחפשת' כל עוד נקבע האטם בעל התנגדות של >30 MΩ. בדרך זו, לבדוק עד 30 נוירונים presynaptic פוטנציאלי.
      הערה: כדי למנוע פגיעה בתא העצב במהלך הליך החיפוש עם מהדק טלאי רופף, יש להחיל רק יניקה עדינה על פיפטת החיפוש בהשוואה לזו המיושמת על פיפטת הטלאים של התא כולו.
   7. אם גירוי במצב אטם 'רופף' גורם ל-EPSP/IPSP (פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר/פוטנציאל פוסט-סינפטי מעכב) עם השהיה <5msec בנוירון הבתר-סינפטי, הסר את פיפטת ה"חיפוש" מתא העצב הקדם-סינפטי.
   8. החלף את פיפטת המדבקה 'המחפשת' באלקטרודת טלאי מלאה בתמיסה פנימית רגילה המכילה ביוציטין. ודא פיפטה תיקון הקלטה זה יש התנגדות של 4 - 8 MΩ; ככל שגודל הסומה גדול יותר, כך התנגדות האלקטרודות יכולה להיות נמוכה יותר.
   9. תקן את תא העצב הקדם-סינפטי והקלט במצב מהדק זרם של תא שלם. לעורר פוטנציאלי פעולה על ידי הזרקת זרם בנוירונים הקדם-סינפטיים ולרשום את התגובה הפוסט-סינפטית. אחסן את הנתונים במחשב לצורך ניתוח מאוחר יותר במצב לא מקוון.

טבלה 1. תמיסת פיפטה כלוריד נמוכה.

	מ"מ	ז/ל	גרם/50 מ"ל
קיי-גלוקונאט	135	31.622	1.5811
KCl	4	0.298	0.0149
HEPES	10	2.384	0.1192
פוספוקריאטין	10	2.552	0.1276
ATP-MG2+	4	2.028	0.1014
GTP-NA	0.3	0.156	0.0078
התאם את ה- pH ל- 7.3 עם KOH
Osmolarity ~300 mOsmol/L
הוסף 3 - 5 מ"ג/מ"ל ביוציטין

טבלה 2. תמיסת פיפטה High Na לחיפוש נוירונים מצומדים סינפטית.

	מ"מ	ז/ל	גרם/50 מ"ל
נא-גלוקונאט	105	22.92	1.146
NaCl	30	1.76	0.088
HEPES	10	2.384	0.1192
פוספוקריאטין	10	2.552	0.1276
ATP-MG2+	4	2.028	0.1014
GTP-NA	0.3	0.156	0.0078
התאם את ה- pH ל- 7.3 עם NaOH
Osmolarity ~300 mOsmol/L

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגבר	הקה	EPC 10 USB טריפל	עם 2-3 מגברים מקדימים
מיקרוסקופ	אולימפוס	BX51WI	עם 2 יציאות מצלמה ויעד של 4×, יעד טבילה במים של 40×
מצלמה	TILL Photonics	VX55	מצלמת CCD אינפרא אדום
העבודה	Luigs &; Neumann	אינפרא פאץ' 240	עם שלב X-Y ממונע וציר מיקוד ממונע למיקרוסקופ
מיקרומניפולטור	Luigs &; Neumann	SM-5	מניפולטורים X-Y-Z עבור 2-3 preamplifiers
כלוב פאראדיי	Luigs &; Neumann
טבלה נגד רטט	ניופורט ספקטרה-פיזיקה
פאצ'מאסטר	הקה
מיקרוטום	מיקרום אינטרנשיונל	HM650V
מושך מיקרופיפטה	הקה	סאטר P-97
מערכת Neurolucida	מיקרוברייטפילד		עם תוכנות Neurolucida ו-Neuroexplorer