כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הקלטות מהדק תיקון
- הניחו את תמיסת האלקטרודות (ראו טבלה 1) על קרח כדי למנוע התפרקות. ממלאים את פיפטת טלאי הזכוכית בתמיסה תוך-תאית מסוננת (מסנן מזרקים, גודל נקבוביות: 0.2 מיקרומטר) ומניחים את הפיפטה במחזיק פיפטה בשלב הראש. החל לחץ עדין וחיובי על פיפטה דרך מזרק 5 מ"ל על ידי עקירה של הבוכנה כ 1 מ"ל לפני הורדת פיפטה לתמיסת האמבטיה.
הערה: פעולה זו מונעת את חסימת הפיפטה.
- בחר במצב "V-clamp" על ידי סיבוב ידית המצב על המגבר, ולאחר מכן פתח את ממשק "בדיקת ממברנה" בתוכנה. הזז את פיפטה קרוב לנוירון המטרה תחת בדיקת מיקרוסקופ.
הערה: בהכנת DRG שלמה, שכבה דקה של תאי גלייה לוויניים עוטפת כל נוירון.
- השתמש בלחץ חיובי מהפיפטה כדי לחצות את שכבת תאי הגליה הלווינית עד שנצפתה הגדלה פתאומית של החלל בין תא העצב לבין השכבה הסובבת את תאי הגליה הלוויניים. המשך להזיז את פיפטה לכיוון תא העצב עד שנצפתה "גומה" על תא העצב.
הערה: בהשוואה להקלטות מתאי עצב מנותקים, הלחץ החיובי צריך להיות מעט גדול יותר, מה שיסייע לחדור את שכבת תאי הגליה הלווינית ולהגדיל את הסיכויים לתיקון מוצלח.
- להפחית את הלחץ החיובי. לאחר מכן, להשיג חותם giga ohm עם יניקה עדינה.
הערה: בשיטה זו, שיעור הצלחת ההקלטה הוא לפחות 70%.
- השג תצורת הקלטה של תא שלם כפי שתואר קודם לכן.
- לחדור לזמן קצר את קרום תא העצב באמצעות יניקה קצרה אך חזקה. לחלופין, השתמש בפונקציית "zap" של המגבר בזמן היניקה.
- לאחר יצירת מצב תא שלם, פצה את הקיבול של התא כולו ואת התנגדות הסדרה (Rs) על-ידי סיבוב ידיות פיצוי הקיבול וההתנגדות במגבר.
הערה: Rs הוא בדרך כלל 5-20 MΩ.
- לנטוש את התא אם Rs הוא בתחילה גדול מ 30 MΩ או משתנה על ידי יותר מ 20% במהלך ההקלטה. כמו כן, למדוד את פוטנציאל קרום המנוחה; לנטוש תא אם הוא יותר מ -50 mV.
- סגור את החלון "בדיקת ממברנה". בחר במצב "I-clamp normal" על ידי סיבוב ידית המצב על המגבר.
- לחץ על "פתח פרוטוקול" בתוכנה, בחר וטען את הפרוטוקול למדידת rheobase. לחץ על "הקלט" כדי להתחיל להקליט. למדוד התנגדות קלט ו rheobase כדי לבחון את ההתרגשות העצבית על ידי הזרקת סדרה מדורגת של זרמים depolarizing בצעדים של 100 pA.
- לחץ על "פתח פרוטוקול" בתוכנה, בחר וטען את הפרוטוקול למדידת rheobase. לחץ על "הקלט" כדי להתחיל להקליט. למדוד התנגדות קלט ו rheobase כדי לבחון את ההתרגשות העצבית על ידי הזרקת סדרה מדורגת של זרמים depolarizing בצעדים של 100 pA.
- השתמש בתוכנה לאיסוף וניתוח נתונים (לדוגמה, Clampfit) כדי לנתח את העקבות המוקלטים בהתאם להוראות היצרן. התוכנה מחשבת את התנגדות הקלט (Rin) בהתבסס על יחסי I-V במצב יציב במהלך הזרמים ההיפרפולריים המועברים. הזז את הסמן כדי למדוד את הערך עבור rheobase וסף הממברנה. הערה: משרעת הזרם הנדרשת להשראת נקודת הגישה מוגדרת כבסיס הריאו, והמתח הנמוך ביותר להשראת נקודת גישה מוגדר כסף הממברנה.
- רשום את הזרמים המושרים על ידי ליגנד.
- ממלאים פיפטה באגוניסטים הספציפיים.
הערה: בדוח הנוכחי, השתמשנו ב- 100 μM גלוטמט ו- 100 μM AITC כדי לגרום לזרמים המתווכים על ידי קולטני גלוטמט וקולטני TRPA1 בהתאמה.
- בדוק את פיפטה כדי לוודא שאין בועות אוויר בפנים. מניחים את פיפטה מחזיק פיפטה. חבר את מחזיק פיפטה עם צינור מחובר למערכת ניפוק סמים.
- השתמש במניפולטור כדי להזיז את פיפטה בתוך 50 מיקרומטר של תא העצב. הגדר את לחץ מערכת ניפוק התרופות ל- 1 psi ואת משך הזמן ל- 1 שניות. החלף את מצב ההקלטה למהדק מתח, ומהדק ב- -70 mV. הפעל בקצרה את הלחץ באמצעות מערכת ניפוק התרופות כדי להקליט זרם המושרה על ידי סמים.
טבלה 1
| 100 מ"ל של תמיסה תוך-תאית |
| ריכוז (mM) | רכיב | מ"ו | ז |
| 130 | קלוקונט | 234.24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238.3 | |
| 10 | EGTA | | |
| 2 | MgCl2*6H2O | 203.3 | |
| הערות: כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם KOH, ואת האוסמולריות ל- 260 - 280 mOsm עם סוכרוז ומים מזוקקים. יש להוסיף 2 mM MgATP, 0.5 mM Na2GTP ולסנן לפני שימוש מיידי. |
