הערכה של סינפסות ברצועת הכלים באזורי תדר ספציפיים של שבלול העכבר

תקציר

מקור: Yu, S., et al. הערכה מורפולוגית ותפקודית של סינפסות סרט באזורי תדר ספציפיים של שבלול העכבר. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון וידאו זה מדגים שיטה להערכת סינפסות רצועת הכלים באזורים ספציפיים של שבלול העכבר. הוא משתמש בטכניקות דימות חיסוני וקונפוקלי כדי לזהות סינפסות תפקודיות על פני אזורי תדר שונים בכל סיבוב שבלול.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. ברירה של בעלי חיים

1. עבור כל הניסויים, השתמש בעכברים זכרים בוגרים C57BL/6J (בני 8 שבועות) כמודל החיה.
   הערה: עכברי C57BL/6J הנושאים גרסה של Splice של Cdh23 מפגינים הזדקנות מואצת במערכת השמע, המתבטאת באובדן של 40% של סינפסות הסרט בסיבוב הבסיסי של השבלול ואובדן של 10% בפנייה האמצעית בגיל 6 חודשים, ואחריו עלייה מהירה של אובדן זה בכל השבלול עם הגיל. לפיכך, אנו ממליצים לנקוט משנה זהירות בעת שימוש בעכברי C57BL/6J שגילם עולה על 6 חודשים למחקר שמיעתי. ניתן להשתמש בזנים אחרים של עכברים בהתאם למטרות ניסוי ספציפיות.
2. בדוק את העכברים באמצעות אוטוסקופ כיס אבחוני מקצועי כדי לשלול פתולוגיות באוזן החיצונית או התיכונה לפני הערכות שמיעה. סימנים אפשריים עשויים לכלול נוזל או מוגלה בתעלת השמע החיצונית, אדמומיות ונפיחות ברקמה מקומית, וניקוב קרום הטימפני.
   הערה: למרות שזה נתקל לעתים רחוקות, לאחר זיהוי, עכברים עם מחלות האוזן החיצונית או התיכונה צריך להיות נכלל.

2. הערכת שמיעה

1. מרדימים עכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית של תערובת קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין הידרוכלוריד (10 מ"ג/ק"ג). לשפוט את עומק ההרדמה באמצעות גירויים כואבים (למשל, רפלקס צביטת בוהן).
   הערה: כאשר רפלקס צביטת הבוהן נעדר לחלוטין, בעל החיים הגיע לעומק מספיק של הרדמה לבדיקה שמיעתית. אם נדרש זמן רב יותר לרישומי ABR דו-צדדיים (תגובת גזע המוח השמיעתית), יש לתת מינון נמוך יותר (חמישית מהמינון המקורי) של חומרי הרדמה כדי לשחזר את מישור ההרדמה המקורי. היזהר להימנע מנת יתר הרדמה, כמו זה עלול להוביל למוות בעכברים.
2. שמרו על טמפרטורת הגוף של בעל החיים המורדם ב-37.5°C באמצעות כרית חימום עם ויסות חום. הניחו את בעל החיים המרדים בחדר מסוכך חשמלית ואקוסטית כדי למנוע הפרעה במהלך בדיקת השמיעה.
   הערה: יש לשמור על הטמפרטורה הפיזיולוגית במהלך כל ההליך עד שבעל החיים ער לחלוטין על מנת למנוע מוות שנגרם כתוצאה מהיפותרמיה שלאחר הרדמה.
3. מניחים אלקטרודות מחט תת-עורית (20 מ"מ, 28 גרם) בקודקוד הגולגולת (אלקטרודת הקלטה), באזור הפרוטיד האיפסילטרלי מתחת לפינה של האוזן הנמדדת (אלקטרודת ייחוס), ובאזור הפרוטיד הנגדי (אלקטרודת קרקע), עם עומק של 3 מ"מ מתחת לעור ראש העכבר, בהתאמה.
4. השתמש ברמקול שדה סגור כדי לבצע גירוי אקוסטי באמצעות צינור פלסטיק בקוטר 2 ס"מ עם קצה בצורת חרוט. הכנס את הקצה לתעלת האוזן החיצונית.
   הערה: ודא שהעכבה החשמלית באלקטרודות ההקלטה והייחוס קטנה מ- 3 kOhm (בדרך כלל 1 kOhm). אם העכבה גבוהה, שנה את אתר ההחדרה של האלקטרודה, נקה את האלקטרודה באלכוהול או החלף את האלקטרודה כדי למנוע שינויים באמפליטודת גל ABR.
5. עבור הקלטת ABR, צור פיפס צליל (משך 3 אלפיות השנייה, זמני עלייה/ירידה של 1 אלפיות השנייה, בקצב של 21.1 לשנייה, תדר: 4-48 קילוהרץ) והצג אותם ברמות לחץ קול יורדות (SPL) מ- 90 ל- 10 dB בשלבי SPL של 5\u201210 dB. במהלך שלב זה, התגובות מוגברות (פי 10,000), מסוננות (0.1-3 קילוהרץ) וממוצעות (1,024 דגימות/רמת גירוי).
   הערה: ABR נאספים עבור כל רמת גירוי ב-10 צעדים של dB, עם 5 צעדים נוספים של dB ליד הסף.
6. בכל תדר, קבע את סף ABR, המתייחס ל- SPL המינימלי וכתוצאה מכך הקלטת ABR אמינה עם גל אחד או יותר הניתנים להבחנה שניתן לזהות בבירור על ידי בדיקה חזותית.
   הערה: בדרך כלל יש צורך לחזור על התהליך עבור SPL נמוך סביב הסף כדי להבטיח את העקביות של צורות הגל. סף התגובה הוא רמת הגירוי הנמוכה ביותר שבה ניתן לצפות בצורת הגל כאשר ירידה של 5 dB תוביל להיעלמות צורת הגל.

3. עיבוד רקמות שבלול

1. לאחר רישום ABR, הרדימו את העכברים המורדמים באמצעות נקע צווארי, ערפו את ראשם, חשפו את הבולה מהצד הגחוני ופתחו אותם עם מספריים חדים כדי לקבל גישה לשבלול.
2. בעזרת מלקחיים עדינים מסירים את העצמות הטמפורליות, מנתקים את עורק הסטיפסים, מסירים את הרצועות מהחלון הסגלגל וקורעים את קרום החלון העגול. צור חור קטן בקודקוד השבלול על ידי סיבוב עדין של קצה המחט (13 מ"מ, 27 גרם).
3. תקן את העצמות המבודדות עם 4% (wt/vol) paraformaldehyde ב 0.1 M פוספט-buffered מלוחים (PBS, pH 7.4) לילה ב 4 ° C. באמצעות פיפטה עדינה, לשטוף בעדינות קיבוע דרך החללים perilymphatic באמצעות יישום על החלונות הסגלגלים או עגולים (כמו מפרצון) ואת הפתח בקודקוד (כמו שקע).
   הערה: חלבונים מסוימים דורשים משך זמן קצר של קיבוע כדי למנוע הרס של האפיטופים שלהם עבור תיוג חיסוני. במקרים כאלה, לדגור על עצמות ב 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 שעות, בהתאם להוראות היצרן עבור immunohistochemistry. קיבוע יכול להתבצע גם באמצעות זילוח לב כדי להסיר את דם השבלול, הימנעות מרעשי רקע עקב כתמים לא ספציפיים בשלבים מאוחרים יותר, במיוחד במודלים עכבריים של סינפטופתיה שבלול.
4. שטפו את העצמות שלוש פעמים במשך 5 דקות עם PBS קר ב-0.1 M כדי להסיר שאריות פרפורמלדהיד. נטרלו את העצמות עם 10% חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) ב-RT למשך 4 שעות או ב-4°C למשך 24 שעות באמצעות ניעור עדין בשייקר אופקי ב-20 סל"ד. ניתן לרענן את EDTA באמצע הדרך.
   הערה: זמני ההסתיידות כפופים לריכוז ה-EDTA ולהעדפות המשתמשים. רקמה מסוידת צריכה לשמור על מידה מסוימת של קשיחות, המאפשרת מניפולציה של בידוד תושבות שבלול שלמות בשלבים מאוחרים יותר. עצמות טמפורליות ניתנות להסתיידות ב-10% EDTA עם סיבוב, מה שמאפשר לחוקרים לעזוב את המעבדה לאחר בדיקות ABR וניסויי קיבוע. זמן ההסתיידות גמיש בטווח של 20 עד 30 שעות ב 4 ° C.
5. העבר עצם טמפורלית אחת מסוידת מ- EDTA ל- 0.1 M PBS. השתמש במלקחיים #3 ו- #5 Dumont ובמחט 27 G כדי לנתח את אזורי השבלול האפיקאלי, האמצעי והבסיסי בתורו ולאחר מכן לנתח את השבלול מתוך העצם תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני. בצעו סדרה של חתכים קטנים לאורך הרצועה הספירלית באמצעות סכין גילוח, והסירו את הממברנה הטקטוריאלית ואת הממברנה של רייסנר (איור 1).
   הערה: כל עוד השבלול המנותח שלם, ניתן לשנות תהליך זה בהתאם לפרוטוקול הרגיל של המפעיל הבודד.
6. נתחו עוד יותר את אפיתל השמע שנותר, כולל הלימבוס הספירלי, לסיבובי שבלול בודדים (קודקוד, אמצע ובסיס עם אזור וו) להכנת הרכבה שלמה.
7. תחת יעד שמן של 40x של מיקרוסקופ אור, למדוד את אורך הממברנה הבזילארית עם קנה מידה של 250 מיקרומטר הממוקם בעינית, אשר ניתן לכוונן לאורך הסטריאוסיליה של IHCs.
8. חשב את האורך של כל סיבוב שבלול על ידי הוספת כל אורכי הקטע (250 מיקרומטר למקטע), וקבל במקביל את האורך הכולל של הממברנה הבזילארית על ידי סיכום האורכים של כל סיבוב.
9. המירו את האורך הכולל של הממברנה הבזילארית, כולל אזור הקרס, לאחוזים בהתבסס על המרחק מקודקוד השבלול (0% מתייחס לקודקוד השבלול, 100% לבסיס השבלול).
10. המרת מרחק זה לתדר אופייני השבלול באמצעות פונקציה לוגריתמית (d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f), עם שיפוע של 1.25 מ"מ/אוקטבה של תדירות, כאשר d הוא המרחק המנורמל מקודקוד השבלול באחוזים, f הוא התדר ב- kHz), כפי שתואר קודם לכן. כך ניתן לרכוש טווח תדרים באזור מקביל של הממברנה הבזילארית בכל סיבוב שבלול.

4. צביעת אימונופלואורסנציה

1. לאחר הנתיחה, הניחו כל סיבוב שבלול בצינור צנטריפוגה נפרד בנפח 2.5 מ"ל ודגרו על סיבובי שבלול ב-10% סרום עיזים/PBS/0.1% Triton X-100 למשך שעה אחת ב-RT על מסובב.
2. הסר את תמיסת החסימה/חדירה הנ"ל מכל צינור באמצעות קצה פיפטה 200 μL תחת מיקרוסקופ דיסקציה ודגר על הדגימות עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בסרום עיזים 5% / PBS / 0.1% Triton X-100 למשך הלילה ב 4 ° C על מסובב.
   הערה: לתיוג חיסוני של סרטים סינפטיים של שבלול, השתמש בעכבר הסמן הפרה-סינפטי נגד חלבון קושר מסוף קרבוקסיל 2 IgG1 (CtBP2, סימון תחום B של חלבון פיגום RIBEYE, 1:400) ובעכבר הסמן הפוסט-סינפטי נגד קולטן אנטי-גלוטמט 2 IgG2a (GluR2, סימון תת-יחידה של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיוני חומצה או קולטן אמפא, 1:200).
3. יש לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם PBS קר 0.1 M כדי להסיר שאריות נוגדנים ראשוניים ולדגור על הדגימות עם נוגדנים משניים מדוללים בסרום עיזים 5% / PBS / 0.1% Triton X-100 ב RT במשך 2\u20123 שעות בחושך על מסובב.
   הערה: הכן תערובות נוגדנים משניים מתאימות באמצעות Alexa Fluor 568 נגד עכבר עזים (IgG1, 1:500) ו- Alexa Fluor 488 נגד עכבר עזים (IgG2a, 1:500), המשלימות את הנוגדנים העיקריים המשמשים בשלב 4.2. כדי לשפר את יעילות ההתוויה עבור סרטים סינפטיים, אנו ממליצים לבחור נוגדנים משניים ספציפיים. מעבדות מסוימות מרחיבות את הדגירה עם נוגדנים משניים כדי להגביר את התיוג החיסוני של GluR2.
4. יש לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם PBS של 0.1 מ"ל כדי להסיר שאריות נוגדנים משניים ולהעביר את הדגימות מצינורות צנטריפוגות של 2.5 מ"ל ללוחות של 35 מ"מ המכילים PBS של 0.1 מ"ל.
5. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה המכילים 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) על השקופית והעבירו את הדגימות מ-PBS למדיום ההרכבה. הניחו קצה אחד של החלקת כיסוי על המגלשה ושחררו כדי לאפשר לכיסוי ליפול בעדינות.
   הערה: כדי להבטיח שתאי השערה פונים כלפי מעלה ושלא מתרחש קיפול או פיתול של דגימות שבלול במהלך ההליך, יש להרכיב דגימות שבלול תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני.
6. מקם את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לאפשר לשקופיות להתייבש ולאחר מכן צלם תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.

5. הערכה מורפולוגית של סינפסות סרט השבלול

1. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם שלושה לייזרים – דיודת UV 405 ננומטר, לייזר ארגון 488 ננומטר ולייזר מצב מוצק שאוב דיודה 561 ננומטר (DPSS) כדי לעורר DAPI (ספקטרום עירור 409–464 ננומטר), Alexa Fluor 488 (ספקטרום עירור 496–549 ננומטר) ו-Alexa Fluor 568 (ספקטרום עירור 573–631 ננומטר), בהתאמה.
2. רכוש ערימות z קונפוקליות למרחק של 8 מיקרומטר מכל סיבוב שבלול באמצעות עדשת טבילת שמן ברזולוציה גבוהה של 63x.
   הערה: לאחר ההגדרה, יש לשמור את כל הפרמטרים לדיגיטציה של פוטומיקרוגרפים ולהחיל אותם באופן אחיד על כל השקפים.
3. עבור ספירת פונקטום סינפטי, הגדר את ערימות z (גודל צעד של 0.3 מיקרומטר) כך שיתפרסו לכל אורך תאי השערה הפנימיים (IHCs), ובכך הבטיחו שניתן יהיה לצלם את כל הפונקטים הסינפטיים.
4. מזג את התמונות המכילות פונקטה באוסף z לקבלת הקרנה של ציר z, וייבא לתוכנת עיבוד התמונה.
5. חלק את הספירות הסינפטיות הכוללות בכל מחסנית z באזורי תדר ספציפיים במספר IHCs (שווה לספירה הידנית הגרעינית של DAPI) כדי לחשב את מספר הפונקטה הסינפטית עבור כל IHC. בכל אזור תדר ספציפי, ממוצע כל הפונקטה הסינפטית בשלוש תמונות של שדות מיקרוסקופיים שונים המכילות 9-11 IHCs.
   1. תאר את אזור האינטרסים (ROIs) כולל האזורים הבזולטרליים של כל IHC באמצעות לחצן בחירות ביד חופשית. השתמש בפונקציית המדידה לכימות אוטומטי של פונקטה, ובפונקציית קו פרשת המים כדי להבחין בין נקודות סמוכות.
   2. לאחר כל ספירה אוטומטית, בצע בדיקות חזותיות עם תיקונים ידניים כדי להבטיח שספירת הפונקטה אמינה.
      הערה: נסיינים צריכים להישאר מסונוורים לגבי האם המגלשה היא מהקודקוד, האמצע או הסיבוב הבסיסי של השבלול.
6. הערכה חזותית של המבנה והתפוצה הסינפטיים כדי לבודד ידנית IHCs בודדים משכניהם באמצעות כלי העיפרון (M) כדי להמחיש טוב יותר את ארכיטקטורת השלד הציטו-שלד ואת הלוקליזציה הסינפטית.
7. כדי לבדוק את הסמיכות של סרטים קדם-סינפטיים (CtBP2) וטלאי קולטן פוסט-סינפטיים (GluR2), חלץ את מרחב הווקסל סביב הסרט בעזרת הכלי סימון בחירה מלבני ובודד את הסרט הבודד על-ידי חיתוך. על-ידי לחיצה על Image > Image Size, קבל מערך תמונות ממוזערות של הקרנות מיניאטוריות אלה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לזהות סינפסות זוגיות (הופיעו כזוגות צמודים של CtBP2-positive ו-GluR2-positive puncta) לעומת סרטים יתומים (ללא טלאי קולטן גלוטמט פוסט-סינפטיים) (איור 2).
   הערה: סינפסות שבלול רגילות מופיעות כתיוג חיסוני משולב של הסרט הקדם-סינפטי בתוך תא השערה (anti-CtBP2) ומדבקת קולטן הגלוטמט הבתר-סינפטית במסוף עצב השמע (anti-GluR2). מעבדות מסוימות משתמשות בהקרנות קונפוקליות בשילוב עם מודלים תלת-ממדיים כדי לכמת גודל או נפח טלאי סינפטי. לפני אובדן משמעותי של סינפסות סרט, סרטים המציגים שינויים בגודל או ללא טלאי קולטן גלוטמט מזווגים מעידים ככל הנראה על תפקוד סינפטי.

תוצאות

איור 1: לוקליזציה של תדר השבלול בעכברים. (A) תמונה מייצגת של השבלול המושתל במלואו, אשר נותח מתוך העצם הרקתית תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני. (B) שבלול העכבר מחולק לסיבובים אפיקליים, אמצעיים ובזאליים, שבהם מסירים את דופן השבלול הצידית. עיגולים אדומים על שברי קרום השבלול מציינים את מיקומי התדרים ואת מיקומם המנורמל המתאים בשבלול (0% מתייחס לקודקוד השב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קטמין הידרוכלוריד	Gutian פרמצבטיקה ושות', בע מ, פוג'יין, סין	H35020148	100 מ"ג/ק"ג
קסילזין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	X-1251	10 מ"ג/ק"ג
מנגנון פיזיולוגי TDT	טאקר-דייוויס טכנולוגיות, אלאצ'ואה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	מערכת פיזיולוגיה שמיעתית III
תוכנת SigGen/BioSig	טאקר-דייוויס טכנולוגיות, אלאצ'ואה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	מערכת פיזיולוגיה שמיעתית III
פד חשמלי	כיף לחיות מחמד	11072931136
מלקחיים Dumont 3#	Fine Science Tools, נורת' ונקובר, קנדה	0203-3-ת.ד
מלקחיים Dumont 5#	Fine Science Tools, נורת' ונקובר, קנדה	0209-5-ת.ד
מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני	Nikon Corp., טוקיו, יפן	SMZ1270
סרום עיזים	ZSGB-BIO, בייג'ינג, סין	ZLI-9021
קולטן אנטי-גלוטמט 2, חוץ-תאי, שיבוט 6C4	Millipore Corp., בילריקה, מסצ'וסטס, ארה"ב (ארצות הברית)	MAB397	עכבר
עכבר מטוהר Anti-CTB2	BD Biosciences, בילריקה, מסצ'וסטס, ארה"ב (ארצות הברית)	612044	עכבר
Alexa Fluor 568 נוגדן IgG1 נגד עכבר	Thermo Fisher Scientific Inc., וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב (ארצות הברית)	A21124	עז
Alexa Fluor 488 נוגדן IgG2a נגד עכבר	Thermo Fisher Scientific Inc., וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב (ארצות הברית)	A21131	עז
אמצעי הרכבה המכיל DAPI	ZSGB-BIO, בייג'ינג, סין	ZLI-9557
מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי	Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה	TCS SP8 II
תוכנת Image Pro Plus	קיברנטיקה מדיה, בת'סדה, MD, ארה"ב	גרסה 6.0
אוטוסקופ כיס אבחון מקצועי	Lude מכשיר רפואי ומכשירים סחר ושות', בע"מ, שנחאי, סין	HS-OT10
אלקטרודת מחט	ידידות אלקטרוניקה רפואית ושות', בע"מ, שיאן, סין	1029	20 מ"מ, 28 גרם
רמקול שדה סגור	טאקר-דייוויס טכנולוגיות, אלאצ'ואה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	CF1