הערכת אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה בתרבית משותפת

תקציר

מקור: Fuchs, Q. et. al., Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-grade Glioma cells into microfluidic devices to evaluating interactions chemical. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את הערכת הפעילות החשמלית העצבית בתרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח שמקורם ב-hiPSC ותאי גליומה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי עם מערכים מרובי אלקטרודות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. פרוטוקול תרבות משותפת

1. התאם את יום הזריעה ואת הריכוז עבור קווי תאים UW479 ו- BT35 כדי להגיע ל -80% מהתאים המשתלבים כאשר צריכה להתחיל תרבית משותפת, המקבילה ל -21 ימי תרבית עבור נוירונים גלוטמטרגיים.
2. טריפסין תאי UW479 ו-BT35 וזרעו אותם על גבי תאי עצב גלוטמטרגיים בכל מכשיר מיקרופלואידי ייעודי (עם צפיפות יעד של 900 תאים/מ"^{מ 2} לכל סוג תא) לפני זריעת תאי גליומות בדרגה גבוהה (pHGG) בילדים לתוך המכשיר המיקרופלואידי המכיל נוירונים גלוטמטריים בשלים.
3. שמרו על התרביות המשותפות במשך יומיים בסביבה מבוקרת (37°C, 5% CO₂) עם נוירון גלוטמטרגי Day11 ואילך מדיום המפורט בטבלה 1.
4. ספור תאי pHGG באמצעות התמונות המיקרוסקופיות שנותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כדי להעריך את הכדאיות שלהם. חישוב אחוז התאים.
   הערה: השתמש בנוסחה הבאה: 100 - ((מספר התאים ב- D23 / מספר התאים ב- D21) x 100).

2. הקלטה אלקטרופיזיולוגית

1. בצע את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית עם מערכת מסחרית ותוכנה זמינה מסחרית.
   הערה: הניסויים בוצעו באמצעות מערך רב-אלקטרודות (MEA) שכלל אלקטרודות בקוטר 30 מיקרומטר במרווחים של 100 מיקרומטר.
2. בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית ראשונה על נוירונים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG. השתמש בנוירונים הגלוטמטרגיים המובחנים כבקרה ותרבת אותם לבד במקביל לתרבות המשותפת. בצע הקלטה שנייה עבור שני התנאים כמתואר בשלב הבא שמספרו 3.
3. בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית שנייה ב- D23 (לאחר יומיים של תרבית משותפת).

טבלה 1: הרכב מדיה תרבית עבור נוירונים גלוטמטרגיים שמקורם ב-hiPS.

רכיבים	מדיום זריעה	D4 בינוני	D7 בינוני	D11 ואילך בינוני
DMEM/F-12 בינוני	פי 0.5	פי 0.25	פי 0.125	Ø
מדיום נוירובזלי	פי 0.5	פי 0.25	פי 0.125	Ø
BrainPhys בינוני	Ø	פי 0.5	פי 0.75	1x
תוספת SM1	1x	1x	1x	1x
תוספת N2-A	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0.5 מ"מ	0.5 מ"מ	0.5 מ"מ	0.5 מ"מ
BDNF	10 נ"ג/מ"ל	10 נ"ג/מ"ל	10 נ"ג/מ"ל	10 נ"ג/מ"ל
GDNF	10 נ"ג/מ"ל	10 נ"ג/מ"ל	10 נ"ג/מ"ל	10 נ"ג/מ"ל
TGF-β1	1 נ"ג/מ"ל	1 נ"ג/מ"ל	1 נ"ג/מ"ל	1 נ"ג/מ"ל
גלטרקס	30 מיקרוגרם/מ"ל	Ø	Ø	Ø
תוסף זריעה	1x	Ø	Ø	Ø
מוסף יום 4	Ø	1x	Ø	Ø

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
בדיקה 40 מיקרומטר עבור מונה שרביט	דוטשר	53750
בדיקה 60 מיקרומטר עבור מונה שרביט	דוטשר	51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	סיגמא	G8541
ארון בטיחות ביולוגי סוג II	תרמו סיינטיפיק	HERASafe סוג KS12
נוירונים גלוטמטרגיים קורטיקליים	BrainXell	BX-0300
DMEM/F12 בינוני	סיגמא	D8437
DPBS 1X	דוטשר	L0615-500
צלוחיות תרבית תאים EasYFlaskTM 75 סמ"ק	אנונימי	156499
סרום בקר עוברי (FBS)	דוטשר	500105
GDNF	פפרוטק	450-10
גלטרקס	לייף טכנולוגיות	A1413201
BDNF אנושי	פפרוטק	450-02
אינקובטור	ממרט	IC0150med
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
מיקרופיפטה P10	סרטוריוס	LH-729020
מיקרופיפטה P100	סרטוריוס	LH-729050
מיקרופיפטה P1000	סרטוריוס	LH-729070
מיקרופיפטה P200	סרטוריוס	LH-729060
Microtube Eppendorf 1.5 מ"ל מנעול בטוח	דוטשר	33290
נסיין רב-ערוצי	MCS	-
תוספת N2-A	StemCell	7152
מדיום נוירובזלי	לייף טכנולוגיות	21103049
תוסף עצבי Neurocult SM1	StemCell	5711
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) ללא L-גלוטמין	דוטשר	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	דראמונד	4000202/4038202
פיפטה לתרבית תאים 10 מ"ל בז®	דוטשר	357551
פיפטה לתרבית תאים 5 מ"ל בז®	דוטשר	357543
שלט chauffante (CultureTemp)	בלארט	370151000
פולי-די-ליזין	סיגמא	P6407
מיקרוסקופ פרימוברט	זיס	415510-1100-000