השתלת מערך אלקטרודות וסיבים אופטיים בהיפוקמפוס של העכבר

Abstract

מקור: Bender, F., et. al., אופטוגנטית של תנודות תטא בהיפוקמפוס בעכברים מתנהגים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההשתלה הסטריאוטקטית של מערך אלקטרודות תיל וסיב אופטי בהיפוקמפוס של מודל עכבר.

Protocol

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת סיבים אופטיים (איור 1A)

1. השתמש בסיבים אופטיים מולטי-מודים (ליבת 105 מיקרומטר, מצופה זכוכית עם ליבת סיליקה, 0.22 NA). הפשיט את חיפוי 125 מיקרומטר של ליבת הסיבים באמצעות מיקרו-חשפנית בזמן שהסיב עדיין מחובר לסליל הסיבים.
2. חותכים את הסיב לאורך של כ 2-3 ס"מ בעזרת סכין יהלום.
3. הכנס את הסיב לטבעת מקל קרמיקה זירקוניה (ID: 126 מיקרומטר). כ- 0.5-1 מ"מ מהסיב האופטי צריך לבלוט מהצד הקמור של הטבעת.
4. בעזרת מחט, מרחו טיפה אחת של דבק אפוקסי על שני קצוות הטבעת, אך לא על דפנות הטבעת. לחלופין, השתמש בדבק סופר.
5. הניחו לדבק להתייבש למשך 30 דקות לפחות.
6. יש ללטש את הצד הקמור של הטבעת באמצעות סרט ליטוש סיבי יהלום (גריסים של 3 מיקרומטר).
7. בדוק את אמינות העברת האור באמצעות מד מתח אופטי.
   1. הגדר את אורך הגל במד ההספק לאותו אורך גל כמו הלייזר בשימוש.
   2. מקם את כבל התיקון כשהקצה פונה למרכז החיישן. הפעל את הלייזר וקרא את תפוקת האור ממד הכוח. רשום את הערך.
   3. חבר את הסיב האופטי לכבל התיקון באמצעות שרוול חיבור ומקם אותו כשקצה הסיב פונה למרכז החיישן. הפעל את הלייזר וקרא את תפוקת האור ממד הכוח. רשום את הערך.
   4. חשב את קצב השידור על ידי חלוקת הערך השני בערך הראשון. אם קצב השידור נמוך מ-0.5, השליכו את הסיב; אחרת, השתמש בו להשתלה.
   5. בדוק את קצב השידור עבור כל סיב לפני ההשתלה.
   6. לניסויים מאוחרים יותר, התאם את תפוקת עוצמת האור של הלייזר לקצב השידור של הסיב האופטי: הגדר את תפוקת האור מקצה כבל התיקון ל-5-15 חלקי קצב השידור כדי להשיג תפוקת אור סופית מקצה הסיב של 5-15 mW.

2. הכנת מערכי חוטי טונגסטן להקלטות LFP (איור 1B)

1. הדביקו כמה (למשל 6) מכווני צינור סיליקה של 100 מיקרומטר במקביל לצד הדביק של פיסת סרט. חותכים חתיכה אחת, כ-4-6 מ"מ, למכלול מערך חוטים אחד.
2. השחילו חוטי טונגסטן 45 מיקרומטר מבודדים דרך צינורות ההנחיה באמצעות מלקחיים.
3. הסירו שישה חוטי מליטה נחושת עדינים מבודדים באמייל (באורך של כ-5 מ"מ) וחוט הארקה (באורך של כ-2-3 ס"מ) באמצעות אזמל כדי לגרד את הבידוד משני הקצוות. הלחמו אותם לפיני הננו-מחברים.
4. חבר כל חוט מליטה לחוט טונגסטן אחד באמצעות טיפה אחת של צבע מוליך כסף, בהתאמה. יש להניח לייבוש למשך 30 דקות לפחות.
5. מרחו כמות מינימלית של מלט לכיסוי החוטים. אין למרוח מלט על חוטי הטונגסטן, שיוכנסו לרקמת המוח, או על החלק העליון של מחבר הננו. תן למלט להתייבש לפחות 30 דקות.
6. בצע חיתוך זוויתי (5-20 °) של חוטי הטונגסטן באמצעות מספריים קהים מנירוסטה כדי לאפשר השתלה אמינה של חוטים מתחת או מעל האזור הסמוך לשכבת הפירמידה, כאשר משרעת התטא נמוכה מכדי להעריך את נאמנות ההתאמה.
7. הסר את הבידוד של קצה חוט ההארקה (כ-2 מ"מ) באמצעות אזמל כדי לגרד את הבידוד. טפל בזה בשטף והלחמה מראש.
8. בדוק שיחות צולבות פוטנציאליות בין אלקטרודות באמצעות מולטימטר דיגיטלי. חבר את פיני המחבר למולטימטר, אותו יש להגדיר למצב מדידת ההתנגדות. בדוק שילובים זוגיים של ערוצים; קריאה במולטימטר מתחת ל-5 MΩ מצביעה על דיבור צולב משמעותי.
9. השתמש במד עכבה כדי לבדוק את העכבה של כל אלקטרודת תיל במי מלח. ערכי עכבה אופייניים הם מתחת ל-100 kΩ.
10. כדי להקל על ההשתלה, הדביקו סיב אופטי אחד למערך החוטים כך שקצה הסיב יהיה בגובה החוט הקצר ביותר וקצה הסיב יהיה בסמיכות אך לא נוגע בחוטי הטונגסטן. שמור על זווית הסיב קטנה ככל האפשר על מנת למנוע נזק לרקמות במהלך ההשתלה.

3. השתלות סטריאוטקסיות

1. הסר את רקמת החיבור מהחלק העליון של הגולגולת ודחף ביסודיות את שרירי הצוואר כלפי מטה בכ-2 מ"מ כדי למנוע חפצי שריר במהלך הרישום.
2. נקו את הגולגולת באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה ותמיסת מלח, וקדחו ארבעה חורים (2 בחזית ושניים מעל המוח הקטן, בקוטר 0.8 מ"מ) כדי למקם ברגי נירוסטה עצם (00-96x1/16) להארקה וייצוב השתל (איור 1D). מקם את בורג ההארקה, המחובר לחוט נחושת אחד (באורך של כ-2-3 ס"מ) מעל המוח הקטן.
3. כסו את בורג הקרקע לחלוטין במלט כדי למנוע חפצי שריר במהלך ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות. בנה טבעת בטון המחברת את כל הברגים (איור 1E).
4. בצע קרניוטומיה מעל צד ההשתלה (היפוקמפוס, AP -1.94, L 1.4, V 1.4 בהתייחס לברגמה). מרחו כ-5 מיקרוליטר של NaCl סטרילי על פני רקמת המוח.
5. הורד לאט את מערך החוטים באמצעות סטריאוטקסיס בגולגולת. להקלטות יחידתיות, השתל בדיקת סיליקון במקום מערך חוטים. כדי למנוע חפצי אור אופטואלקטריים, השתלו את הסיב האופטי בנפרד בהיפוקמפוס כאשר קצה הסיב אינו פונה ישירות לבדיקה (איור 1C—I). לצורך חקירת תיאום החיבור בין ההמיספרות, השתל סיב אופטי נוסף באזור CA1 של ההיפוקמפוס הנגדי.
6. כדי להגן על רקמת המוח, יש למרוח כ-5 מיקרוליטר שעווה נוזלית חמה/שמן פרפין, שחומם מראש ב-70 מעלות צלזיוס, עם מזרק מעל מקום ההשתלה.
7. מרחו מלט סביב מערך החוטים וכסו את הגולגולת במלט.
8. החל טיפה אחת של שטף על חוט ההארקה/ייחוס המולחם מראש ועל החוט המולחם מראש המחובר לבורג ההארקה באמצעות, למשל, מחט, ומזג את החוטים באמצעות מכונת הלחמה.
9. מכסים את כל חוט האדמה במלט.
10. יש לתת 0.3 מ"ל Erycinum (1:4 ב-NaCl סטרילי) וקרפרופן (5 מ"ג/מ"ל) i.p. לאחר הניתוח ולפחות ביומיים שלאחר מכן. העכבר מתעורר בדרך כלל תוך 15 דקות לאחר הניתוח. חממו את החיה עם מנורה אדומה כדי להאיץ את ההתאוששות.
11. עקוב אחר משקל העכבר מדי יום בשבוע הראשון לאחר הניתוח או עד שהוא יציב. ירידה במשקל לא תעלה על 10% מהמשקל המתועד של העכבר לפני הניתוח. כדי להאיץ את ייצוב המשקל, ספק לעכבר מזון רטוב וחלב מרוכז במהלך הימים הראשונים לאחר הניתוח.
12. כדי לתעד את הפעילות התאית של ההיפוקמפוס במהלך ההתאוששות, השתלו בדיקת סיליקון בהיפוקמפוס (AP -1.94, L 1.4, V 1, עם הנמכה לאחר מכן) (איור 1C—I). השתל את הסיב האופטי בהיפוקמפוס ב-AP -3, L 1.4, V 1.6, 39° זנב-רוסטרלי. אם רוצים גירוי של סומטה תאית, השתלו סיב אופטי נוסף בטרשת נפוצה (AP +0.98, L 1, V 3.9, 15° לרוחב).

Results

איור 1: איור של סיבים אופטיים, אלקטרודות וניתוחים. (A) איור של סיב אופטי. (B) איור של מערך חוטים המודבק לסיב אופטי לרישום LFP בהיפוקמפוס במהלך שילוב תנודות תטא בהיפוקמפוס. (C) לתיעוד הפעילות התאית של ההיפוקמפוס, מותקן בדיקת סיליקון על מיקרו-כונן. (D) ברגים מיניאטוריים ממוקמים על הגולגולת. חוטי נחושת מולחמים מראש לקרקע וברגי ייחוס לפ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
עכברי PV-Cre	מעבדת ג'קסון	ב6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
סטריאוטקסיס	דייוויד קופף אינסטרומנטס, טוג'ונגה, קליפורניה, ארה"ב	דגם 963	מכשיר סטריאוטקסי מדויק במיוחד לבעלי חיים קטנים
מקדחים, 0.8 מ"מ	Bijoutil, Allschwil, שוויץ	49080HM
תחנת הלחמה	Weller Tools GmbH, Besigheim, גרמניה	WSD 81
אריתרומיצין	Rotexmedica GmbH, Trittau, גרמניה	PZN: 10823932	1 גרם אבקה לתמיסה לעירוי
מקדחה/משחזת דיוק	Proxxon, Wecker, לוקסמבורג	fbs 240/e
סיב אופטי מולטי-מוד	ThorLabs, דכאו, גרמניה	FG105LCA	0.22 NA, Low-OH, Ø105 מיקרומטר ליבה, 400 - 2400 ננומטר
טבעת מקל קרמיקה	מוצרי סיבים מדויקים, מילפיטאס, קליפורניה, ארה"ב	CFLC126	קרמיקה LC MM Ferrule, ID 126um
נייר ליטוש	ת'ורלאבס	LF3D	6 אינץ' x 6 אינץ' גיליון ליטוש יהלום
מד כוח	ת'ורלאבס	PM100D	קונסולת מד חשמל ואנרגיה קומפקטית, LCD דיגיטלי בגודל 4 אינץ'
מצמד סיבים אופטיים מולטי-מוד	ת'ורלאבס	FCMM50-50A-FC	1x2 מ"מ מצמד, יחס מפוצל 50:50, 50 מיקרומטר סיבי GI, FC/PC
כבל תיקון סיב אופטי	Thorlabs	FG105LCA CUSTOM-MUC	בהתאמה אישית, באורך 3 מ', עם צינורות מגן, צינורות: FT030, מחבר 1: FC/PC, מחבר 2: 1.25 מ"מ (LC) טבעת קרמית
שרוול	מוצרי סיבים מדויקים, מילפיטאס, קליפורניה, ארה"ב	ADAL1	שרוול הזדווגות מפוצל קרמי עבור טבעות Ø1.25 מ"מ (LC/PC)
חוטי טונגסטן	California Fine Wire Company, גרובר ביץ', קליפורניה, ארה"ב	CFW0010954	40 מיקרומטר, 99.95%
צינורות נימיים	אופטרוניקה	1068150020	מזהה: 100.4 מיקרומטר
ננו-מחבר אומנטיקה	Omnetics Connector Corporation, מיניאפוליס, ארה"ב	A79038-001
ברגים	בילאני, דיסלדורף, גרמניה	00-96x1/16	פלדת אל-חלד
צבע מוליך כסף	Conrad electronics, גרמניה	530042
שטף נוזלי	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)