בקרה אופטוגנטית של דינמיקת רשת ההיפוקמפוס

תקציר

מקור: Manseau, F., et al. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את השיטה להשתמש באופטוגנטיקה כדי לווסת את הדינמיקה של רשת ההיפוקמפוס על ידי הפעלת נוירונים בין-עצביים מהונדסים גנטית הרגישים לאור בפרוסת מוח של עכבר, שיפור סנכרון תנודות תטא ולימוד התנהגות מעגלים עצביים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. בקרה אופטוגנטית בהיפוקמפוס המבודד
   הערה: לצורך בקרה אופטוגנטית של פעילות רשת ההיפוקמפוס, משתמשים כאן באסטרטגיה ספציפית מסוג תא הכוללת הפעלה קצבית של תאי GABAergic המכילים PV (פרוואלבומין חיובי), שכן תאים אלה הוכחו כממלאים תפקיד מרכזי בסנכרון אוכלוסיות תאים עיקריות בהיפוקמפוס המבודד. ביטוי סלקטיבי של הצ'נלרודופסין-2 המעורר (ChR2) בתאי PV מושג על ידי חציית קו העכבר PV-Cre עם עכברים המבטאים באופן קונסטיטוטיבי ChR2 Cre-dependly (Ai32), ובכך יוצרים עכברי PV-ChY. לחלופין, מבנים וקטוריים נגיפיים (למשל, AAVdj-ChETA-eYFP) יכולים להיות מוזרקים לתוך ההיפוקמפוס של עכברי PV-Cre או PV-TOM (P15-16) כדי להניע את הביטוי של אופסין מעורר בתאי עצב CA1/SUB (איור 1A).
   1. מקם אלקטרודת LFP באזור CA1/SUB (Cornu ammonis-1/subiculum) ותקן תא פירמידלי סמוך בהיפוקמפוס המבודד של עכבר המבטא את האופסין המעורר ChR2 הרגיש לאור כחול באינטרנוירונים PV.
   2. הניחו מדריך אור סיב אופטי (קוטר 0.2 - 1 מ"מ) מעל הכנת ההיפוקמפוס ומרכז אותו באזור המוקלט. השתמש באור כחול (473 ננומטר) ממקור LED לגירוי אופטוגנטי, המורכב מפעימות אור (10 - 20 אלפיות השנייה, המופעלות על ידי אות לוגי טרנזיסטור-טרנזיסטור) או פקודות מתח גל סינוס המועברות בתדרי תטא (4 - 12 הרץ).
   3. עבור למהדק הנוכחי ואפיין את פעילות הפירמידה במהלך תנודות תטא ספונטניות.
   4. הפעל את פרוטוקול הגירוי והקלט את תגובות האור. שימו לב שתנודות שדה ופעילות סינפטית בתא העצב המוקלט מסונכרנות יותר ויותר במהלך גירוי אופטוגנטי, ושקצב קצבי של תאי PV מביא לשליטה איתנה הן בתדירות והן בעוצמתן של תנודות תטא (איור 1).

תוצאות

איור 1: פוטנציאל שדה מקומי והקלטות מהדק טלאי סימולטני מתאי עצב פירמידליים ופוטו-וולטאיים בודדים מסוג CA1/SUB במהלך תנודות תטא ספונטניות ומונעות אופטוגנטית בהיפוקמפוס המבודד.

(a) דיאגרמה המציגה את אתרי רישום האלקטרודות LFP והתיקון עם מיקום מדריך סיבי האור מעל אזור CA1/SUB המבטא אופסין רגיש לאור כחול (ChETA יחד עם eYFP פלואורופור). (b) אפיון...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
נתרן כלורי	סיגמא אולדריץ'	S9625
סוכרוז	סיגמא אולדריץ'	S9378
סודיום ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	S5761
NaH2PO4 - נתרן פוספט מונובייסיק	סיגמא אולדריץ'	S8282
מגנזיום גופרתי	סיגמא אולדריץ'	M7506
אשלגן כלורי	סיגמא אולדריץ'	P3911
D-(+)-גלוקוז	סיגמא אולדריץ'	G7528
סידן כלורי דיהידראט	סיגמא אולדריץ'	C5080
נתרן אסקורבט	סיגמא אולדריץ'	A7631-25G
ציוד
95% O2/5% תערובת גז CO2 (קרבוגן)	ויטלר	SG466204A	מערכת זילוח
בקבוקי זכוכית/צלוחיות זכוכית (4 x 1 ליטר)	נ.א.	נ.א.	מערכת זילוח
תא הקלטה שקוע	עיצוב מותאם אישית (FM)	נ.א.	ניתן להשתמש בחלופה מסחרית
מגבר מהדק טלאי Multiclamp 700B	התקנים מולקולריים	MULTICLAMP	אלקטרופיזיולוגיה
תוכנית מפקד Multiclamp 700B	התקנים מולקולריים	MULTICLAMP	אלקטרופיזיולוגיה
ממיר דיגיטלי/אנלוגי	התקנים מולקולריים	DDI440	אלקטרופיזיולוגיה
מיקרומניפולטורים (הפעלה ידנית)	סיסקיו	MX130	אלקטרופיזיולוגיה (LFP)
מיקרומניפולטורים (אוטומטיים)	סיסקיו	MC1000e	אלקטרופיזיולוגיה (תיקון)
צג שמע	מערכות A-M	דגם 3300	אלקטרופיזיולוגיה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף שנבנה בהתאמה אישית	סיסקיו	נ.א.	דימות
מצלמת וידאו אנלוגית	קוהו	4912-2000/0000	דימות
תופס מסגרות דיגיטלי עם תוכנת הדמיה	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	דימות
אולימפוס 2.5x מטרה	אולימפוס	MPLFLN	דימות
מטרת טבילה במים אולימפוס 40x	אולימפוס	UIS2 LUMPLFLN	דימות
מערכת דיודה פולטת אור (LED) בהתאמה אישית	מנהג	נ.א.	גירוי אופטוגנטי (Amhilon et al., 2015)
חיות
PV::עכברי Cre (KI)	מעבדת ג'קסון	מספר מניה 008069	אפשר ביטוי גנים מכווני Cre בנוירונים בין-עצביים PV
עכברי Ai9 מותנים (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	מעבדת ג'קסון	מספר מניה 007905	Express TdTomato בעקבות רקומבינציה בתיווך Cre
עכברי Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	מעבדת ג'קסון	מספר מניה 012569	בטא את חלבון ההיתוך המשופר channelrhodopsin-2/EYFP בעקבות חשיפה ל- Cre recombinase
עכברי PVChY	בגידול הבית	נ.א.	צאצאים שהתקבלו מהכלאה של קו PV-Cre עם עכברי Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP