$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת ביוריאקטור
- יצירת תבניות ביוריאקטור
- הורד קובץ CAD של ביוריאקטור (תכנון בעזרת מחשב) מקובץ CAD משלים או צור עיצוב מותאם אישית.
- צור נתיב כלים CNC (בקרה נומרית ממוחשבת) מהמודל התלת-ממדי באמצעות תוכנת CAM (ייצור בעזרת מחשב).
- מכונת תבניות אצטליות באמצעות מכונת כרסום CNC.
- ייצור ביוריאקטורים
- מערבבים בסיס 10:1 לתערובת חומר מרפא של פולידימתילסילוקסאן (PDMS, 77 גרם תערובת לכל 4 פלטפורמות/תבניות).
- הכניסו את התערובת לתא ואקום, סגרו את כל השסתומים, הפעילו את השואב ונטרלו את הגז למשך 30 דקות לפחות עד שלא נותרו בועות אוויר. יוצקים את התערובת לתבניות ומורידים את הגז מהתבניות בתא הוואקום למשך שעה.
- סגרו את התבניות עם החצי העליון של התבנית בכיוון הנכון. מניחים מוט משושה מפלדה מעל המרכז ומהדקים משני הצדדים.
- מלאו מחדש את החלק העליון ב-PDMS.
- לרפא את התבניות בתנור 65 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות.
- מוציאים את הפלטפורמות מהתבניות לאחר הקירור לטמפרטורת החדר.
- נקה את המכשירים באמבטיה קולית באמצעות 1 שעות מחזורים של סבון כלים, 400 מ"ל של 100% איזופרופנול, ומים מזוקקים.
- יבש לילה ב 65 °C.
- השרו את כיסויי הזכוכית בפוליאול פעילי שטח לא יוניים 1% למשך 30 דקות, וודאו שהם לא נערמים כך שכולם מצופים כראוי.
- יש לשטוף היטב במים מזוקקים ולייבש למשך הלילה ב-65°C.
- טפלו בכיסויי הזכוכית ובפלטפורמת PDMS עם חומר ניקוי פלזמה גבוה עם 6 ליטר חמצן למשך 1-2 דקות. לאחר הטיפול, חבר את השניים יחד על ידי לחיצה על PDMS כלפי מטה על הכיסוי במשך 30 שניות לפחות.
- בצע Autoclave של התקנים מלוכדים לפני הוספת תאים.
2. בניית מערך גירוי אופטי
- באמצעות מערכת קוביות כלוב 30 מ"מ, חבר מראה דיכרואית 573 ננומטר במרכז. חברו LED אדום של 627 ננומטר (דיודה פולטת אור) עם מסנן עירור ארוך של 594 ננומטר וחברו אותו לצד העליון של הקובייה, כאשר נורית ה-LED פונה למראה. לאחר מכן חברו נורית LED כחולה בגודל 488 ננומטר עם מסנן עירור קצר של 546 ננומטר לצד הסמוך של הקובייה, כאשר נורית ה-LED פונה למראה כפי שמוצג בסכמה באיור 1A.
- חברו דיאפרגמת קשתית המופעלת באמצעות טבעת לתחתית קוביית הכלוב כדי לשלוט בגודל האזור המואר.
- הפעל כל נורית LED באמצעות מנהל התקן T-Cube LED ושליטה באמצעות לוח Arduino Uno Rev3. חבר את הקלט הצדדי של מנהל התקן ה- LED לתקע מקור חשמל, חבר את הפלט האמצעי לארדואינו וחבר את יציאת הצד ישירות לנורות ה- LED.
- חבר את Arduino Uno למחשב עם כבל USB.
- הורד קבצים מקישור GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
- פתח את הקובץ "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" מתיקיית GitHub.
- הגדר פרמטרים התחלתיים: שלבים = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
- ודא שפלט פין 4 מוקצה למנהל ההתקן של נורית ה- LED הכחולה ופלט פין 2 מוקצה למנהל ההתקן של נורית ה- LED האדומה. בדוק שהחוטים האמצעיים של מנהל התקן ה- LED מחוברים לקרקע ולפלט הפינים המתאים.
- הידור ולטעון את תוכנית "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" לארדואינו.
- חבר כל מנהל התקן LED לערוץ המתאים לו.
3. מערך תרבית תאים (יום -21-0)
- תאי שריר שלד ראשוניים
- הפשירו והרחיבו מיובלסטים ראשוניים של השלד (המתקבלים מקוק מיוסיט) למשך שישה מעברים לכל היותר באמצעות מדיום גדילה מיוטוני (+ תוסף). שמור על תאים באינקובטור המוגדר ל 37 ° C ו 5% CO2.
- שנה את המדיה כל יומיים.
- ברגע שהתאים נפגשים בכ-60%, העבירו אותם באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA (1x, למשך 5 דקות ב-37°C). אספו את התאים המנותקים והוסיפו מדיה טרייה כדי לנטרל את הטריפסין.
- סובבו את התאים במהירות של 300 x גרם ושאפו את הסופרנאטנט מעל גלולת התא.
- להשעות מחדש את התאים עם MGM וזרע 1: 3 עם 60 מ"ל לכל צלוחיות תלת שכבתיות.
- ChR2-hiPSC
הערה: כל קווי התאים לעבודה זו נוצרו ושימשו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ארה"ב. בפרוטוקול זה, hiPSCs המבטאים ChR2 נוצרו באמצעות עריכת גנום CRISPR-Cas9 בשיטות שתוארו קודם לכן18, אך ניתן להשתמש בכל קווי התאים האופטוגנטיים היציבים (לנטיויראלי, חזירי וכו') באותו אופן. נבחרו מקדמים מכוננים המתבטאים הן בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים והן במוטונוירונים (CAG). התאים נמצאו בעלי קריוטיפים בריאים, כפי שצוין בפרסומים קודמים.
- מצפים צלחות 6 בארות עם 1 מ"ל / באר של מטריצת קרום מרתף מסיס מדולל ב- DMEM/F12 (1:80) ודוגרים על הלוחות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- זרעים iPSCs על צלחות מצופות 6 בארות עם 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא מזין (מדיה iPSC), החלפת 2 מ"ל של מדיה כל יומיים ועובר כל 5-7 ימים. שמור על תאים באינקובטור המוגדר ל-37°C ו-5% CO2.
- פס"ד
- נתק את תאי הגזע על ידי דגירה שלהם עם 1 מ"ל של מגיב משחרר תאי גזע ללא אנזימים למשך 4 דקות וגזירה מכנית שלהם עם פיפטה P1000 בעלת קצה רחב.
- תאי זרעים ביחס של 1:24 או 1:48 במדיית iPSC עם 2 מיקרומטר של Y-27632 דיהידרוכלוריד ב-2 מ"ל/באר על לוחות מצופים בעלי 6 בארות.
4. זריעת רקמת שריר השלד (יום -3)
- בודד וספור 30 x 106 מיובלסטים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
- מרחפים מחדש את המיובלסטים בתערובת 4:1 של 3 מ"ג/מ"ל קולגן I ומטריצת קרום מרתף מסיס (800 מיקרוליטר תערובת קולגן + 200 מיקרוליטר מטריצת קרום מרתף כדי להגיע לנפח סופי של 1 מ"ל). עבור מרכיב הקולגן, יש להוסיף את החומר המנטרל הנלווה (תערובת של קולגן ביחס 9:1 לחומר מנטרל) ולדלל את התערובת עם PBS 1x לקבלת נפח של 800 μL.
- הוסיפו 15 מיקרוליטר של תרחיף קולגן תאי לכל תא שריר בביוריאקטור, והקפידו לפזר את המתלה על פני שני העמודים באמצעות קצה פיפטה (איור 2).
- תנו לתערובת הג'ל התאית להתפלמר בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ולאחר מכן מלאו היטב כל ביוריאקטור ב-450 μL של מצע גידול מיוטוני.
- לאחר 3 ימים (לאחר שהג'ל נדחס), התחל התמיינות myotube.
5. הבחנה Myotube (ימים 0-14)
- התחל עירוי myotube על ידי החלפת רקמות ל 450 μL של מדיה מעוררת היתוך (FS, טבלה 1) במשך 7 ימים, החלפת המדיה כל יומיים.
הערה: נסה להתחיל התמיינות myotube באותו יום של התמיינות motoneuron מ hiPSCs על מנת לזרוע motoneurons בסוף לוחות הזמנים התמיינות של שני סוגי התאים.
- ביום השביעי שנו את המדיה ל-450 מיקרוליטר של מדיית התבגרות Ia (MMIa, טבלה 1).
- ביום ה-9, יש לשנות ל-450 מיקרוליטר של מדיית ההבשלה Ib (MMIb, טבלה 1).
- ביום ה-11, שנה את המדיה ל-450 μL של NbActiv4. המשך לשנות את המדיה כל יומיים עד שהמוטונוירונים נזרעים (שלב 7).
6. התמיינות מוטונורון (ימים 0-14)
- ביום 0, העבירו 4 x 106 ChR2- hiPSCs לצלחת פטרי חיבור נמוכה במיוחד עם 15 מ"ל של מדיום תרבית תרחיף מוטונורון (MSCM, טבלה 1). תוסף MSCM עם 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate ו 5 μM Y-27632 dihydrochloride.
- ביום השני, בודדו את הנוירוספרות (NS) עם מסננת הפיכה של 37 מיקרומטר ולוחמו מחדש ב-15 מ"ל MSCM עם CHIR99021 של 3 מיקרומטר, LDN193189 של 0.2 מיקרומטר, SB431542 של 40 מיקרומטר וחומצה רטינואית של 0.1 מיקרומטר. לאחר יום 2, NS צריך להיות גלוי בצלחת פטרי ללא שימוש במיקרוסקופ.
- ביום הרביעי, העבירו את התאים והמדיה לצינור של 50 מ"ל ואפשרו לנוירוספרות לשקוע לתחתית (5 דקות). שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-15 מ"ל של MSCM בתוספת 0.5 מיקרומטר SAG, 0.2 מיקרומטר LDN193189, 40 מיקרומטר SB431541 ו-0.1 מיקרומטר חומצה רטינואית.
- ביום השביעי, חזור על שלב 6.3. אבל להשעות מחדש את התאים ב 15 מ"ל של MSCM בתוספת 0.5 מיקרומטר SAG ו 0.1μM חומצה רטינואית.
- ביום 9, חזור על שלב 6.3. אבל להשעות תאים ב 15 מ"ל של MSCM בתוספת 10 μM DAPT.
- ביום ה-11, חזור על שלב 6.3, אך השהה מחדש את התאים ב-15 מ"ל MSCM בתוספת BDNF של 20 ננוגרם/מ"ל ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
- ביום ה-14, זרעו את המוטונוירונים לתוך הרציף.
7. זריעת מוטונוירונים מצטברים בביוריאקטור (יום 14)
- הכינו תערובת ג'ל 4:1 של 2 מ"ג/מ"ל קולגן I ומטריג'ל (800 מיקרוליטר תערובת קולגן + 200 מיקרוליטר מטריגל כדי להגיע לנפח סופי של 1 מ"ל). עבור מרכיב הקולגן, הוסיפו את החומר המנטרל הנלווה (תערובת של קולגן ביחס 9:1 לחומר המנטרל) ודללו את התערובת עם PBS 1x כדי להגיע לנפח סופי של 800 μL.
- השתמש במסננת תאים של 400 ננומטר כדי לבחור נוירוספרות גדולות ולהשהות אותן מחדש בתערובת הג'ל.
- שאפו מדיה מהמאגר ובזהירות מהבאר הנוירוספרית (איור 2).
- הוסף 15 μL של תערובת ג'ל לתוך ערוץ נוירוספרה.
- טען פיפטה 10 μL עם 10 μL של ג'ל ולאחר מכן לבחור נוירוספירה אחת.
- הפקידו את ה-NS בתעלה הנוירוספרית וודאו שה-NS נמצא בחדר. לאט להרים את פיפטה תוך שחרור הג'ל שנותר ברגע NS הוא הניח. אם אינך בטוח שה- NS הופקד כראוי, בדוק את מיקומו באמצעות מיקרוסקופ.
- אפשר לג'ל להתפלמר במשך 30 דקות ב-37°C.
- למאגרים, הוסף 450 μL של NbActiv4 בתוספת 20 ng/mL BDNF ו- 10 ng/mL GDNF.
- החליפו את המדיה כל יומיים כדי לאפשר צמיחה אקסונלית מ-NS לרקמת שריר.
8. גירוי אופטי סימולטני והקלטת וידאו של פונקציית NMJ (יום 24+)
- להדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת מוליך למחצה משלימה מדעית של תחמוצת מתכת (sCMOS).
- הגדר את תוכנת המצלמה ל- 2x2, חשיפה ל- 20 אלפיות השנייה, תריס מתגלגל מופעל, קצב קריאה ל- 540 MHz, טווח דינמי: 12-bit & gain 1, ומצב חיישן: חפיפה.
- השתמש 2x מטרה על המיקרוסקופ כדי לדמות את microtissues.
- חבר תא חי (37°C, 5% CO2) לשלב המיקרוסקופ.
- בחר את אזור העניין (ROI) המכיל את רקמת רקמות השלד העצביות כדי למזער את גודל הקובץ ואת זמן העיבוד.
- מקם מסנן פליטה ארוך של 594 ננומטר בין הדגימה לבין מטרת ההדמיה כדי לסנן פולסים של אור כחול מהמצלמה.
- הניחו צלחת מלבנית בת 4 בארות המכילה 4 ביוריאקטורים (24 רקמות) לתוך תא התא החי.
- לחץ על Live View. מרכז ומקד את התמונה עם החזר ההשקעה הרצוי.
- העלה את קוד המאקרו המותאם אישית מתיקיית GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) כדי לשלוט במיקום הבמה, בלוח הארדואינו וברכישת הווידאו.
- הגדר סרט פלט כ- day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
- הפעל את קוד המאקרו עם קואורדינטות X,Y הרצויות שנקבעו על הבמה וקבל קיטוע זמן מהיר עם 1700 מסגרות ב- 50 מסגרות לשנייה.
- יש להחליף את המדיה לאחר ההדמיה ולהחזיר את הדגימות לאינקובטור. אפשר לפחות 24 שעות בין פגישות רכישת תמונה כדי למנוע עייפות רקמות.
