מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

תקציר

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. מיקרו-הזרקה

1. הכן ניתוח סטרילי על ידי ניגוב המכשיר הסטריאוטקסי ביסודיות עם 70% אתנול. טבלו את המכשיר הכירורגי ב-70% אתנול כדי לעקר אותו.
2. שפשפו את ראש הגור ב-70% אתנול. אתר את הלמבדה המהווה ציון דרך על הגולגולת וסמן את הלמבדה בעט טוש. כוון את קצה המחט אל הלמבדה, והגדר את הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות (AP) והמדיאליות-צדדיות (ML) כאפס.
3. הזיזו את זרוע ההזרקה לאתר המטרה בהתאם לקואורדינטות X ו-Y של אתר המטרה. עבור הסטריאטום של גורי יום לאחר הלידה (P) 2, הקואורדינטות הן: AP, +2.4 מ"מ קדמי ללמבדה; ML, ±1.0 מ"מ לרוחב מקו האמצע; גבי-גחון (DV), -1.7 מ"מ מהגולגולת. סמן את מיקום הצבע הירוק המהיר בצינור PE10 בעזרת עט.
4. הורידו את מחט ההזרקה 30G לאט כדי לחדור דרך העור והגולגולת, ולאחר מכן הרימו את קצה המחט עד שהיא נעצרת על פני הגולגולת. הגדר את קואורדינטות ה- DV לאפס.
5. הורד לאט את מחט ההזרקה 30G עד שהיא מגיעה לקואורדינטות ה-DV של אתר היעד. המתן דקה אחת כדי לאפשר לפרנכימה לחזור לצורתה הרגילה. לאחר מכן, הפעל את תוכנית המיקרו-הזרקה (100 nL/min).
6. ודאו שהסימן של צבע ירוק מהיר נע בצינור ה-PE כדי להבטיח שנוזל הנגיף מוזרק למוח.
7. המתן דקה אחת לאחר סיום המיקרו-הזרקה, ולאחר מכן העלה את המחט לאט ובהדרגה ל-1/2 גובה עומק ה-DV תוך 30 שניות. לאחר 30 שניות, משוך לאט את המחט מראשו של הגור.

2. התאוששות לאחר ניתוח של הגור

1. לחמם את הגור למשך 20 דקות באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס. בדוק את התאוששות הגור מהרדמת היפותרמיה כל 5 דקות עד שהגור חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה
2. החזירו את הגור לסכר לאחר שהגור התאושש לחלוטין.

חומרים