עיכוב פעילות עצבית ואיתור שלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בחולדה

תקציר

מקור: Lai, J., et al. רישום אלקטרופיזיולוגי בו זמנית ומיקרו-הזרקות של חומרים מעכבים במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת מיקרו-הזרקה להקלטה ועיכוב עצביים בו זמנית בקוליקולוס העליון של החולדה. ההליך כולל מיקוד סטריאוטקסי, קידוח גולגולת והחדרת מזרק, המספק נוירוטרנסמיטר מעכב תוך רישום פעילות עצבית. גירוי אור מעורר פוטנציאל פעולה, בעוד שמיקרו-הזרקת סמים מדכאת את הריגוש העצבי. ככל שרמות המוליכים העצביים יורדות, הפעילות העצבית חוזרת לנקודת ההתחלה, ומאפשרת לחקור הן את העיכוב והן את ההתאוששות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הרכבת פיפטת הזרקת הקלטה

1. משוך נימי זכוכית באורך של כ-7 ס"מ (קוטר חיצוני של 1 מ"מ) באמצעות מושך פיפטה.
2. שברו את קצה הנימים ובדקו את הצמצם תחת מיקרוסקופ אור. ודא שהקוטר הפנימי הוא בין 30 מיקרומטר ל -40 מיקרומטר.
3. הכנס חוט כסף באורך 7 ס"מ לתוך נימי הזכוכית עם כ-1 ס"מ בולט מהקצה הלא מחודד של פיפטת הזכוכית.
4. כופפו את החוט העודף בצורה אורתוגונלית לנימים הזכוכית.
5. מרחו טיפה של דבק פלסטי גמיש על הפיר של מחט היפודרמית 30 גרם.
6. הכנס מחט היפודרמית של 30 גרם לפיפטת הזכוכית בהתאם לסכמות המוצגות באיור 1.
7. הוסף ציפוי דבק שני כדי להבטיח איטום תקין מהצומת בין פיפטת הזכוכית למחט ההיפודרמית.
8. השאירו את הפיפטה לייבוש כשהקצה פונה כלפי מעלה למשך כ-12 שעות כדי להבטיח ריפוי נכון של הדבק. התוצאה המוגמרת מוצגת באיור 2.

הערה: הליך זה נעשה בניסויים חריפים ואין צורך בעיקור של קצה הפיפטה.

2. הכנת בעלי חיים

1. הניחו את החולדה בקופסת הרדמה.
2. השראת הרדמה באמצעות איזופלורן 4% למשך 5 עד 10 דקות.
3. הנח את החיה על שולחן סטריאוטקסי עם כרית חימום ובדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בקונוס אף כדי לשמור על הרדמה עם 2% איזופלורן. אבטח את ראש החולדה באמצעות מוטות אוזניים ומחזיק שיניים.
4. יש למרוח משחת עיניים או טיפות עיניים, הכוללות טיפות אטרופין 1% כדי לסייע בהרחבת האישונים. כדי למנוע יובש, יש למרוח טיפות סיכה בערך כל 30 דקות.
5. גלחו את הראש ונקו אותו עם 10% פובידון-יוד.
6. להרדמה מקומית, יש להזריק 0.5 מ"ל של לידוקאין 2% מתחת לקרקפת ב-2-3 מקומות על ידי הרמת העור והחדרת קצה המחט.
7. אשר רמת הרדמה נאותה על ידי ביצוע צביטה בבוהן והתבוננות בחוסר התנועה. בנוסף, עקוב אחר הדופק כדי לוודא שהוא נמצא בערכים הנורמליים (300 עד 400 פעימות לדקה).
8. חתכו את הקרקפת בקו ישר לאורך החציון עם להב אזמל #10 כדי לחשוף את התפרים העטרתיים והסגיטליים.
9. חשוף את נקודות הלמבדה והברגמה על ידי דחיפת הרקמה המכסה את הגולגולת בעזרת מרית כירורגית.
10. יישר את הגולגולת כך שתנוחות ברגמה ולמבדה יהיו באותו מישור.
11. כדי להגדיר את נקודת הייחוס, השתמש במכשיר סטריאוטקסי עם צינור זכוכית מותקן כדי להציב אותו ממש מעל ברגמה. זה יהיה ה"אפס" עבור קואורדינטות המדידות האנטרו-אחוריות והמדיאליות-רוחביות.
12. הגדר את נקודת העניין על ידי הזזת התושבת הסטריאוטקסית לקואורדינטות הנדרשות, שים לב לקואורדינטות הסטריאוטקסיות וצייר ריבוע סביב אזור היעד המסמן היכן תבוצע הגולגולת.
13. השתמש במקדחה כירורגית עם מקדח מעוקר לאורך הריבוע המסומן לאט ללא לחץ כדי להסיר לאט את חומר העצם. היזהר לא לקדוח זמן רב מדי באותו אזור, מכיוון שהוא יפיק חום ויגרום לנגעים בקליפת המוח.
14. כאשר העצם התוחמת את הגולגולת הופכת דקה מספיק, הסר בזהירות את חלק הגולגולת בעזרת פינצטה כדי לחשוף את קליפת המוח.
15. השקה לעתים קרובות את קליפת המוח החשופה בנוזל מוחי מלאכותי כדי למנוע ייבוש רקמות.
    הערה: הסרת Dura mater מיותרת על החולדה מכיוון שקצה המזרק יציב מספיק כדי לחדור.

3. מילוי והרכבה של מערכת ההזרקה

1. מלאו את המיקרו-מזרק של 5-10 מיקרוליטר על ידי שאיפה בשמן מינרלי.
2. מלאו את המחט ההיפודרמית בפיפטת הזכוכית הקבועה בתמיסה של 0.5% Chicago Sky Blue (CSB) ו-300 מיקרומטר חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA) או תמיסה של 2% לידוקאין עם 0.5% CSB. מדללים את כל התמיסות במי מלח.
   1. במקרה של חומר בשפע, יש למלא באמצעות מזרק רגיל ולהשתמש בטכניקות הזהירות הרגילות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
   2. במקרה של חומרים יקרים יותר, השתמש בשמן מינרלי למילוי המזרק ולאחר מכן ניתן להכניס את החומר הכימי על ידי שאיפה. מכיוון שהפרש הצפיפות בין שמן מינרלי למים גבוה יחסית, חומר זה הוא מועמד טוב להזרקת תמיסות מימיות.
      הערה: ניתן להוסיף צבע כדי לאשר את ההפרדה בין שני נוזלים.
3. למילוי פיפטת ההזרקה, מלאו מזרק של 1 מ"ל בתמיסה על ידי שאיפה ולאחר מכן הזריקו לאט את התמיסה לתוך פיפטת ההזרקה.
4. שימו לב היטב לדליפות באזורים המצוינים באיור 1 על ידי ניקוי אזורים אלה והתבוננות בדליפות על ידי הזרקה איטית של התמיסה עם המזרק.
5. הסר את המזרק של 1 מ"ל. בעת ביצוע פעולה זו, הקפד לשמור על לחץ קל על הבוכנה כדי שהשואב לא יסיר את התמיסה מפיפטת ההזרקה.
6. מלאו את המיקרו-מזרק בשמן מינרלי על ידי שאיפה והצמידו אותו בחוזקה לפיפטה ההזרקה הממולאה, ולאחר מכן נגבו בזהירות כל תמיסה עודפת מהמזרק המורכב בגזה.
7. ודא שהקצה אינו חסום על ידי הזרקת נפח קטן מאוד, מספיק כדי לראות טיפה קטנה שנוצרת בקצה פיפטת הזכוכית.
8. התקן את המזרק על מערכת המיקרו-משאבות וודא שהוא קבוע היטב.
9. מקם בזהירות את קצה המזרק בקואורדינטות המטרה והורד את הקצה לפני השטח של קליפת המוח.
10. הורד לאט את המזרק באמצעות המנגנון הסטריאוטקסי למבנה המטרה (קוליקולוס מעולה במקרה זה) באמצעות הקואורדינטות האנטומיות המתאימות.
11. מכסים את קליפת המוח החשופה באגר חם כדי למנוע ייבוש רקמות.

4. הזרקה והשבתה הפיכה

1. הגדר את משאבת המיקרו-הזרקה להזריק 400 עד 800 נ"ל ב-40 נ"ל/דקה ולחץ על הפעל כדי להתחיל בהזרקה. שימו לב שקצב הספייק יראה ירידה במהלך ההזרקה.
   הערה: במערך הניסוי, הפעילות העצבית התאוששה תוך שעה לאחר סיום מתן GABA. ניתן להשתמש בכל מכשיר מכני מכויל כדי להפעיל לחץ על מזרק המיקרו-הזרקה על מנת לבצע את ההזרקה.
2. לאחר רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, המתת חסד בשיטה שאושרה על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של מכלול ההזרקה. מזרק מיקרו (A) מחובר לפיפטה ההקלטה-הזרקה, המורכבת ממחט תת-עורית של 30 גרם (B) המודבקת לחוט כסף (C) בתוך פיפטת זכוכית (D). אזורים מוקפים בע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
משאבת הזרקה (UltraMicroPump III)	WPI
קונסולת הזרקה (בקר Micro4)	WPI	#SYS-MICRO4
מזרק המילטון	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	מזרקים בין 5 ל -10 מיקרוליטר משומשים
דבק ג'ל ציאנואקרילט	Krazy Glue	KG86648R	קל יותר ליישם את צורת הג'ל על פיר המחט ההיפודרמית 30G
פיפטות זכוכית	WPI	#TW100F-4	קיר דק, 1 מ"מ OD, 0.75 מ"מ מזהה עם פיפטות נימה בשימוש
720 חולץ פיפטות מחט	Kopf	720
חוט כסף	A-M Systems, Inc.	782500	חשוף "0.010

#UMP3