העברת גנים תת-פיאליים בחוט השדרה של העכבר כדי להעריך את ביטוי הגנים

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנה כללית לבעלי חיים וכירורגיה

1. לפני תחילת ההליך הכירורגי, יש להפשיר את הנגיף (AAV9-UBI-GFP [UBI: מקדם יוביקוויטין, GFP: חלבון פלואורסצנטי ירוק]; 5 מיקרוליטר aliquots). הכן תמיסת דקסטרן 5% (10,000 מגה-וואט) על ידי ערבוב אבקת דקסטרן במים מזוקקים. מערבבים את תמיסת הנגיף עם תמיסת דקסטרן 5% ביחס של 1:1 לריכוז דקסטרן סופי של 2.5%.
   1. אחסן את תמיסת הווירוס על קרח (4 מעלות צלזיוס).
2. השתמש בעכברי C57BL/6J בוגרים (זכר ונקבה, 20-30 גרם). להרדים את העכברים באמצעות איזופלורן 5% (ב-O₂, 1 ליטר לדקה) ולשמור אותם על איזופלורן בשאיפה של 2-3% (ב-O₂, 1 ליטר לדקה) על ידי חרוט האף במהלך הניתוח, תלוי בקצב הנשימה ובתגובת צביטת הכפות.
3. לגלח את גב החיות בעזרת קוצץ גילוח ולנקות את העור עם 2% כלורהקסידין.
4. במחקרי החלמה כרוניים, עקוב אחר טכניקה סטרילית קפדנית.
5. אם יש לבצע זריקות תת-פיאליות מותניות, חתוך את העור המכסה את חוליות Th8-L1 בעזרת אזמל ונתק את השריר הפרה-חולייתי מחוליות עמוד השדרה Th10-12 באמצעות מספריים.
   1. הרכיב את החיה למסגרת סטריאוטקסית סטנדרטית באמצעות מהדקי עמוד השדרה של העכבר.
   2. גלחו את שני צידי הלמינה של חוליות Th10-12 באמצעות מקדחה דנטלית (מקדחה: 0.9 מ"מ, מהירות: 20,000 סל"ד) עד להופעת סדקים.
   3. הסר שברי עצם סדוקים בעזרת מלקחיים וחשוף את פני הגב של חוט השדרה המותני.
   4. חותכים את הדורה כ -1 ס"מ בעזרת מחט נירוסטה 30 גרם ומלקחיים.

2. פתיחת קרום הפיאל והכנסת המחט התת-פיאלית למשלוח AAV9

1. התקן את המחט החודרת 34 G pia לתוך זרוע ה-Z של מניפולטור XYZ באמצעות מחזיק נימי זכוכית (איור 1A ו-B).
   הערה: לייצור המחט החודרת לפיה, הקצה המשופע המקורי של מחט 34G מושחז באמצעות שיפוע נימי זכוכית עם צלחת שוחקת יהלום - גס (קצה 5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר גדלים) וזווית טחינה של 15 - 20°. קצה המחט (אורך 1 מ"מ, נמדד מהקצה) מכופף בעדינות לכ-90 מעלות (איור 1B, תוספת שמאלית).
2. באמצעות סקופ ניתוח כירורגי, המוגדר להגדלה של 8-10X, חדרו ל-pia עם המחט החודרת ל-pia בכ-1 מ"מ (איור 1C) באמצעות זרוע ה-X.
   1. שמור על זווית המחט החודרת למשטח הרקמה ב-5-10°.
3. אחרי פתיחת הפיה, הסירו את המחט החודרת לפיה אופקית מהחלל התת-פיאלי (איור 1D) באמצעות זרוע ה-X.
   הערה: זכרו את האזור שחדר אליו ציון דרך, כמו למשל כלי דם.
4. טען מחט הזרקה קהה 36G עם נגיף AAV9-UBI-GFP באמצעות מיקרו-מזרק של 50 מיקרוליטר המחובר למחט ההזרקה עם צינורות PE-10 או PE-20.
5. התקן את המחט לתוך זרוע ה-Z של מניפולטור XYZ שני (איור 1A ו-B) באמצעות מחזיק נימי זכוכית (איור 1B, תוספת ימנית).
   הערה: כדי לייצר את מחט ההזרקה AAV9 התת-פיאלית, הקצה הקהה של מחט 36 G מלוטש באמצעות שיפוע נימי זכוכית עם צלחת שוחקת יהלום - גס (גדלי קצה של 5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר) כדי להסיר את הקצוות החדים. קצה המחט (אורך 2-3 מ"מ, נמדד מהקצה) מכופף בעדינות לכ-90°. מחטי ההזרקה החודרות והתת-פיאליות מוחדרות לצינורות נירוסטה 20G באורך 1-2 ס"מ (10 מ"מ מקצה המחט) ומודבקות באפוקסי. השימוש בצינורות 20 גרם (קוטר 0.91 מ"מ) נדרש לחיבור מאובטח למחזיק נימי הזכוכית.
6. על ידי מניפולציה של זרועות X, Y ו-Z של המניפולטור השני, מקם את קצה מחט ההזרקה AAV9 לתוך האתר שחדר ל-pia ולאחר מכן קדם אותו כ-2-3 מ"מ לתוך החלל התת-פיאלי דרך פתח הממברנה הפיאלית הקודמת באמצעות זרוע ה-X (איור 1E ו-F).
   הערה: 1) ה-AAV9-UBI-GFP מוכן על פי פרוטוקולים שדווחו בעבר, והטיטרים הסופיים מותאמים ל-1.2 x^{10 13} עותקי גנום למ"ל (gc/mL). 2) אין צורך לסמן את אתר הפתח של הפיאל מכיוון שהוא ניתן לזיהוי בקלות (איור 1D).
7. הזרקו את ה-AAV9-UBI-GFP (1.5, 3 או 5 מיקרוליטר) לחלל התת-קרקעי באמצעות מיקרו-מזרק של 50 מיקרוליטר (ראה טבלה 1 לקבוצות ניסוי).
8. הסר את מחט ההזרקה מהחלל התת-קרקעי לאחר השלמת הזרקת AAV9-UBI-GFP.
9. סגור את השריר והעור באמצעות תפר מונופילמנט 4.0 וקליפסים כירורגיים.
   הערה: אין צורך לאטום את החוליה הפתוחה.
10. אפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית חימום.
11. לשליטה בכאב, יש להזריק בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג/סמ"ק כל 12 שעות למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח.

טבלה 1: קבוצות ניסוי. כל הניסויים בוצעו בעכברי C57BL/6J בוגרים.

איור 1: מערך ניסיוני לביצוע הזרקות תת-קרקעיות בעמוד השדרה בעכבר בוגר. (A) כדי לבצע הזרקות תת-פיאליות בעמוד השדרה בעכברים בוגרים, משתמשים בשני מניפולטורים נפרדים של XYZ (I ו-II). (ב) זרוע ה-Z של כל מניפולטור מחזיקה מחזיק נימי זכוכית. מחזיק נימי אחד מחזיק את מחט ה-34 G החודרת לפיה, והשני מחזיק את מחט ההזרקה התת-פיאלית הקהה של 36 G. (ג, ד, ה' ו-ו) תמונות המתארות את מיקום המחט החודרת לפיה מיד לאחר ניקוב הפיה (C; חומר הדורה כבר הוסר), לאחר הסרת המחט החודרת לפיה (D), לאחר החדרת קצה מחט ההזרקה התת-פיאלית (E), ולאחר קידום מחט ההזרקה התת-פיאלית 3 מ"מ לתוך החלל התת-פיאלי (F).