העברת גנים תת-פיאליים בחוט השדרה של העכבר כדי להעריך את ביטוי הגנים

תקציר

מקור: Tadokoro, T., et al. העברת וקטור תת-פיאלי הקשור לאדנו 9 (AAV9) בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים טכניקת הזרקה תת-פיאלית להעברת גנים לחוט השדרה בעכברים. ההליך כולל חשיפת הדורה מאטר, ניקוב ה-pia mater והזרקת נגיף אדנו-הקשור רקומביננטי (rAAV) הנושא גן המבטא חלבון פלואורסצנטי לחלל התת-פיאלי. לאחר ההזרקה וההתאוששות, הנגיף מקל על ביטוי גנים בתאי חוט השדרה, ומאפשר לחקור את ביטוי גן המטרה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנה כללית לבעלי חיים וכירורגיה

1. לפני תחילת ההליך הכירורגי, יש להפשיר את הנגיף (AAV9-UBI-GFP [UBI: מקדם יוביקוויטין, GFP: חלבון פלואורסצנטי ירוק]; 5 מיקרוליטר aliquots). הכן תמיסת דקסטרן 5% (10,000 מגה-וואט) על ידי ערבוב אבקת דקסטרן במים מזוקקים. מערבבים את תמיסת הנגיף עם תמיסת דקסטרן 5% ביחס של 1:1 לריכוז דקסטרן סופי של 2.5%.
   1. אחסן את תמיסת הווירוס על קרח (4 מעלות צלזיוס).
2. השתמש בעכברי C57BL/6J בוגרים (זכר ונקבה, 20-30 גרם). להרדים את העכברים באמצעות איזופלורן 5% (ב-O₂, 1 ליטר לדקה) ולשמור אותם על איזופלורן בשאיפה של 2-3% (ב-O₂, 1 ליטר לדקה) על ידי חרוט האף במהלך הניתוח, תלוי בקצב הנשימה ובתגובת צביטת הכפות.
3. לגלח את גב החיות בעזרת קוצץ גילוח ולנקות את העור עם 2% כלורהקסידין.
4. במחקרי החלמה כרוניים, עקוב אחר טכניקה סטרילית קפדנית.
5. אם יש לבצע זריקות תת-פיאליות מותניות, חתוך את העור המכסה את חוליות Th8-L1 בעזרת אזמל ונתק את השריר הפרה-חולייתי מחוליות עמוד השדרה Th10-12 באמצעות מספריים.
   1. הרכיב את החיה למסגרת סטריאוטקסית סטנדרטית באמצעות מהדקי עמוד השדרה של העכבר.
   2. גלחו את שני צידי הלמינה של חוליות Th10-12 באמצעות מקדחה דנטלית (מקדחה: 0.9 מ"מ, מהירות: 20,000 סל"ד) עד להופעת סדקים.
   3. הסר שברי עצם סדוקים בעזרת מלקחיים וחשוף את פני הגב של חוט השדרה המותני.
   4. חותכים את הדורה כ -1 ס"מ בעזרת מחט נירוסטה 30 גרם ומלקחיים.

2. פתיחת קרום הפיאל והכנסת המחט התת-פיאלית למשלוח AAV9

1. התקן את המחט החודרת 34 G pia לתוך זרוע ה-Z של מניפולטור XYZ באמצעות מחזיק נימי זכוכית (איור 1A ו-B).
   הערה: לייצור המחט החודרת לפיה, הקצה המשופע המקורי של מחט 34G מושחז באמצעות שיפוע נימי זכוכית עם צלחת שוחקת יהלום - גס (קצה 5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר גדלים) וזווית טחינה של 15 - 20°. קצה המחט (אורך 1 מ"מ, נמדד מהקצה) מכופף בעדינות לכ-90 מעלות (איור 1B, תוספת שמאלית).
2. באמצעות סקופ ניתוח כירורגי, המוגדר להגדלה של 8-10X, חדרו ל-pia עם המחט החודרת ל-pia בכ-1 מ"מ (איור 1C) באמצעות זרוע ה-X.
   1. שמור על זווית המחט החודרת למשטח הרקמה ב-5-10°.
3. אחרי פתיחת הפיה, הסירו את המחט החודרת לפיה אופקית מהחלל התת-פיאלי (איור 1D) באמצעות זרוע ה-X.
   הערה: זכרו את האזור שחדר אליו ציון דרך, כמו למשל כלי דם.
4. טען מחט הזרקה קהה 36G עם נגיף AAV9-UBI-GFP באמצעות מיקרו-מזרק של 50 מיקרוליטר המחובר למחט ההזרקה עם צינורות PE-10 או PE-20.
5. התקן את המחט לתוך זרוע ה-Z של מניפולטור XYZ שני (איור 1A ו-B) באמצעות מחזיק נימי זכוכית (איור 1B, תוספת ימנית).
   הערה: כדי לייצר את מחט ההזרקה AAV9 התת-פיאלית, הקצה הקהה של מחט 36 G מלוטש באמצעות שיפוע נימי זכוכית עם צלחת שוחקת יהלום - גס (גדלי קצה של 5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר) כדי להסיר את הקצוות החדים. קצה המחט (אורך 2-3 מ"מ, נמדד מהקצה) מכופף בעדינות לכ-90°. מחטי ההזרקה החודרות והתת-פיאליות מוחדרות לצינורות נירוסטה 20G באורך 1-2 ס"מ (10 מ"מ מקצה המחט) ומודבקות באפוקסי. השימוש בצינורות 20 גרם (קוטר 0.91 מ"מ) נדרש לחיבור מאובטח למחזיק נימי הזכוכית.
6. על ידי מניפולציה של זרועות X, Y ו-Z של המניפולטור השני, מקם את קצה מחט ההזרקה AAV9 לתוך האתר שחדר ל-pia ולאחר מכן קדם אותו כ-2-3 מ"מ לתוך החלל התת-פיאלי דרך פתח הממברנה הפיאלית הקודמת באמצעות זרוע ה-X (איור 1E ו-F).
   הערה: 1) ה-AAV9-UBI-GFP מוכן על פי פרוטוקולים שדווחו בעבר, והטיטרים הסופיים מותאמים ל-1.2 x^{10 13} עותקי גנום למ"ל (gc/mL). 2) אין צורך לסמן את אתר הפתח של הפיאל מכיוון שהוא ניתן לזיהוי בקלות (איור 1D).
7. הזרקו את ה-AAV9-UBI-GFP (1.5, 3 או 5 מיקרוליטר) לחלל התת-קרקעי באמצעות מיקרו-מזרק של 50 מיקרוליטר (ראה טבלה 1 לקבוצות ניסוי).
8. הסר את מחט ההזרקה מהחלל התת-קרקעי לאחר השלמת הזרקת AAV9-UBI-GFP.
9. סגור את השריר והעור באמצעות תפר מונופילמנט 4.0 וקליפסים כירורגיים.
   הערה: אין צורך לאטום את החוליה הפתוחה.
10. אפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית חימום.
11. לשליטה בכאב, יש להזריק בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג/סמ"ק כל 12 שעות למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח.

טבלה 1: קבוצות ניסוי. כל הניסויים בוצעו בעכברי C57BL/6J בוגרים.

קבוצות ניסוי	אתר/רמת אספקת AAV9 (*)	נפח AAV9 inj, קצב עירוי	זמן הישרדות	ניתוח רקמות
קבוצה A (n = 7)	C2 (דו צדדי)	5 μL/5 דקות	14 ימים	מוח + חוט שדרה
קבוצה B (n = 12)	L1-L2 (דו צדדי)	1.5 מיקרוליטר או 3 מיקרוליטר, 60 שניות/מיקרוליטר	14 ימים	מוח + חוט שדרה
קבוצה C (n = 6)	C2 + L1-L2 (דו-צדדי בכל רמה)	5 μL/5 דקות	14 ימים	חוט
* - דו-צדדי = שתי זריקות תת-פיאליות, אחת מועברת לחלל התת-קרקעי הימני ואחת לחלל התת-פיאלי השמאלי של המקטע/ים המוזרקים.

השדרה

תוצאות

איור 1: מערך ניסיוני לביצוע הזרקות תת-קרקעיות בעמוד השדרה בעכבר בוגר. (A) כדי לבצע הזרקות תת-פיאליות בעמוד השדרה בעכברים בוגרים, משתמשים בשני מניפולטורים נפרדים של XYZ (I ו-II). (ב) זרוע ה-Z ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C57BL/6J עכברים	מעבדות ג'קסון	664
מעבדה סטנדרטית סטריאוטקסית לעכברים	מכשיר הרווארד	72-9568
מתאם עמוד שדרה עכבר	מכשיר הרווארד	72-4811
XYZ מניפולטור	Stoelting	51604
משאבת עירוי ידנית	Stoelting	51218
34G מחט ננופיל משופעת	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G מחט ננופיל קהה	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI אספקה וטרינרית	502017
תמיסת כלורהקסידין	MWI אספקה וטרינרית	501027
20 גרם מחט נירוסטה	בקטון-דיקינסון	305175
23 גרם מחט נירוסטה	בקטון-דיקינסון	305145
30 גרם מחט נירוסטה	Becton-Dickinson	305128
כותנה קצה מוליך	MWI אספקה וטרינרית	27426
זכוכית נימי Beveller	Narishige International	SM-25B
מיקרוסקופ שקופיות Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl מיקרו-מזרק	המילטון	81242
BD Intramedic PE-20 צינורות	Becton, Dickinson	427406
BD צינורות PE-10 Intramedic	Becton, Dickinson	427401
4-0 תפר מונופילמנט	VetOne	V1D397
זכוכית נימי Beveller	Narishige	Pipet מטחנת מיקרו EG-40
5 דקות אפוקסי (אפוקסי שקוף)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	מעבדת ליבת וקטור ויראלית UCSD