השתלת חלון חוט השדרה בעכבר להדמיה in vivo

תקציר

מקור: Pietruczyk, E. A., et al. כריתת למינקטומיה והשתלת חלון חוט השדרה בעכבר. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים השתלת חלון חוט שדרה בעכבר מורדם להדמיה in vivo. הפרוטוקול מייצב את חוט השדרה החשוף באמצעות זכוכית כיסוי בורוסיליקט ולוח אחורי מודפס בתלת מימד. שיטה זו מאפשרת מיקרוסקופיה דו-פוטונית ברזולוציה גבוהה לחקור דינמיקה של מחסום דם-מוח ואינטראקציות נוירו-וסקולריות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השתלת זכוכית כיסוי

1. מרחו בעדינות זכוכית כיסוי בורוסיליקט 3 מ"מ על הכבל החשוף.
2. ודא שהאגרוז מקורר ל-39 מעלות צלזיוס. בעזרת מרית קטנה, מרחו 2% אגרוז/aCSF (נוזל מוחי מלאכותי) חם על קצה זכוכית הכיסוי ואפשרו לפעולה נימית כדי למשוך אותה מתחת לפני השטח.
   הערה: בטמפרטורות מתחת ל-39 מעלות צלזיוס, האגרוז עשוי להתחיל לג'ל. במקרה כזה, יש לחמם מחדש באמצעות אמבט מים או מיקרוגל. חלק מהמפעילים מעדיפים למרוח תחילה טיפה אחת של אגרוז ולהניח את זכוכית הכיסוי מעל.
3. מרחו דבק רקמות על התהליכים המפרקיים הגרמיים החשופים של החוליות הסמוכות השלמות ברמת בית החזה 11 בעמוד השדרה החולייתי וברמת בית החזה 13 בעמוד השדרה החולייתי. מרחו דבק רקמות נוסף בטבעת סביב אתר כריתת הלמינקטומיה, מעל הגיד הסמוך והתהליך הרוחבי.
   הערה: דבק רקמות נדרש להיצמדות נכונה למלט הדנטלי בשלבים הבאים. התהליכים המפרקיים יוצרים מושב טבעי שעליו הלוח האחורי יכול לנוח ביציבות (איור 1). הידבקות לתהליכים המפרקיים תהווה את נקודות ההתקשרות החזקות ביותר.
4. מערבבים מלט דנטלי עם מאיץ במגש ערבוב חרסינה. השתמש במרית קטנה כדי להעביר מלט דנטלי לשכבת דבק הרקמות. השתמש במלט דנטלי כדי להדביק את הלוח האחורי לשדה הניתוח המרוכז מעל החלון. המתן 10 דקות להחלמת הצמנט הדנטלי.
   הערה: ההידבקות האיתנה של הלוח האחורי לתהליכים המפרקיים הקדמיים והאחוריים מספקת את היציבות המבנית הבסיסית של השתל.
5. השתמש במלט דנטלי נוסף כדי למלא את הבסיס הפנימי של הלוח האחורי, ואת הצד התחתון של הלוח האחורי: ממשק רקמות.
   הערה: היישום הנוסף של צמנט דנטלי משפר את ההיצמדות ומפחית את הסיכון לדליפה של נוזל טבילה אובייקטיבי במיקרוסקופ (מלוח) החוצה מתחתית הלוח האחורי.
6. קדם את מחזיק הלוח האחורי המזלג למצב המתאים מעל החלון. אבטח את הלוח האחורי לתוך מחזיק הלוח האחורי באמצעות ברגים.
   הערה: פרוטוקול זה השתמש במחזיק לוח אחורי בעיבוד מותאם אישית (איור 2G\u2012H).
7. מרחו מי מלח על הלוח האחורי כדי לבדוק דליפה. אם נוזל כלשהו דולף, יבש את האזור ומרח עוד מלט דנטלי.

2. הכנת הדמיה

1. העבירו את החיה לפלטפורמה הכירורגית לשולחן האופטי.
   הערה: ניתן להעביר את הפלטפורמה הכירורגית שלנו, מחזיק הלוח האחורי ומחזיק חרוט האף של איזופלורן בין תחנות הדמיה כירורגיות ושני פוטונים כיחידה אחת תוך הפעלת הרדמה איזופלורן רציפה (איור 2D, H). ניתן להרכיב יחידות דומות ממזלגות אחיזה, קורות ועמודי עמודים תומכים שניתן להשיג ממקורות מסחריים (למשל, ThorLabs). עבור מיקרוסקופיה תוך-חיונית, צריך להיות מרווח של לפחות 11 אינץ' בין מטרת המיקרוסקופ לשולחן האופטי כדי להתאים לגובה הפלטפורמה הניתוחית.
2. הצמד את הפלטפורמה הכירורגית לשולחן האופטי באמצעות עמוד הרכבה מנירוסטה ומזלג הידוק משועמם.
3. מרחו מי מלח טריים לבאר הלוח האחורי. הורד עדשת טבילה במים לבאר.
4. השתמש באור משודר או אפיפלואורסצנטי כדי לזהות את אזור העניין והמיקוד. עבור למצב סריקת לייזר ובצע הדמיה in vivo על פי מסנני אורך הגל של עירור לייזר דו-פוטוני, דיכרואי ופס פס המתאים עבור הפלואורופורים הקיימים ברקמה6.

תוצאות

איור 1. תיאור סכמטי של המיקום האנטומי של חלון חוט השדרה. א) תיאור סכמטי של המראה העליון של גוף חוליה בית החזה התחתון, תהליך קוצני ומקטע חוט השדרה (sc). עיגול מקווקו מתאר את מקום מושב התהליך המפרקי, נקודת התמיכה העיקרית להדבק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אחורי סגלגל מודפס בתלת מימד	מותאם אישית		מייצב שדה הדמיה
מיקרוסקופ ניתוח כירורגי	Leica	M205 C	מצויד ב-Leica FusionOptics, מטרה מסדרת Planapo 0.63x M ושלב
גלישהמצלמת מיקרוסקופ	Leica	MC170	HD מצלמה צבעונית להדמיית שדה כירורגי
שלב גלישה	Leica	10446301	שלב הגלישה בנוי משתי לוחות מתכת. לוחית הבסיס קבועה. הצלחת העליונה מחליקה על ממשק משומן כדי לאפשר תנועה סיבובית וליניארית.
תחנה כירורגית ומזלג ייצוב	לוויתן Manufactoring	מותאם אישית	Laminectomy
SomnoSuite יחידת אספקת איזופלורן בזרימה נמוכה	קנט סיינטיפיק	SS-01	ניהול הרדמה כירורגית עם וופורייזר דיגיטלי משולב
נירוסטה 1.5 אינץ' עמוד הרכבה	ThorLabs	P50/M	להרכבת תחנה כירורגית על שולחן אופטי להדמיה
דו-פוטוניתמזלג הידוק משועמם להרכבה בגודל 1.5 אינץ' Post	ThorLabs	PF175	לייצוב תחנה כירורגית הרכבה על שולחן אופטי להדמיה של שני פוטונים
מיקרו-מקדחה עצם אידיאלית	מנגנון הרווארד	72-6065	עצם דלילה לכריתת למינקטומיה
אמבט מים	פישר סיינטיפיק	15-462-10	התחממות
מי מלח אקדח קוטרי	FST	18010-00	צריבה של דימומים קלים
כרית חימום	Benchmark	BF11222	1.9 אינץ' x 4.5 אינץ' מחמם סיליקון עם מובילי טפלון 20 אינץ', 10W,
בדיקה רקטלית מצמד תרמי מסוג	Physitemp	RET3	מדידת טמפרטורת גוף
העכבר ג'לי נפט	סיגמא	8009-03-08	בדיקה רקטלית סיכה
בקר תרמי מווסת משוב	מותאם אישית	NA	החלופות הזמינות מסחרית כוללות את סדרת Physitemp TCAT
PVA חניתות עיניים כירורגיות	Beaver-visitec international	40400-8	סופג דם
גוזם חשמלי	Wahl	41590-0438	חיתוך להב פרוות עכבר
, #11	FST	14002-14	מלקחיים לכלי כירורגי
, #5	FST	11254-20	לכלי כירורגי
, #4	FST	14002-14	כלי כירורגי
מלקחיים עם שיניים טיטניום	WPI	555047FT	כלי כירורגי
מספריים טיטניום איריס	WPI	555562S	כלי כירורגי
דבק רקמות Vetbond	3M	084-1469SB	הכנת משטח רקמה למגש ערבוב קרמי אקרילי דנטלי
	ג'ק ריצ'סון	420716	ערבוב חומר אקרילי דנטלי עם מאיץ
Orthojet אקריליק דנטלי	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	הדבקה לצמיתות של לוח אחורי לרקמה
זכוכית כיסוי עגולה קטנה, עובי #1, 3 מ"מ	מכשיר הרווארד	64-0720	חלון אופטי
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	עבור aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	עבור aCSF
גלוקוז	פישר סיינטיפיק	50-99-7	עבור aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	עבור aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	עבור aCSF
CaCl₂··2H₂O	Fisher Scientific	#################	עבור aCSF
קרפרופן	רימדיל	QM01AE91	משככי כאבים
מים בקטריוסטטיים	הנרי שיין	2587428	מדלל לקרפרופן
איזופלורן	הנרי שיין	11695-6776-2	הרדמה
תמיסת צלצול חלב	בקסטר	0338-0117-04	הידרציה לעכבר
Agarose High EEO	Sigma	A9793	נקודת ג'ל 34-37 מעלות צלזיוס
משחת סיכה אופטלמית	Akwa Tears	68788-0697	מניעת ייבוש קרנית
MOM מיקרוסקופ דו-פוטוני	סאטר

לוח 5V K מלקחיים