עטיפת גורם גדילה עצבי בננו-חלקיקים המחקים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

תקציר

מקור: Zhu, J., et. al., הכנה ואפיון של ננו-חלקיקים חדשים המחקים HDL עבור אנקפסולציה של גורם גדילה עצבי. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ההרכבה המדורגת של ננו-חלקיקים מחקי HDL טעוני NGF באמצעות אנקפסולציה בסיוע פרוטמין והרכבה עצמית מבוססת שומנים ליישומי אספקה נוירוטרופיים פוטנציאליים.

פרוטוקול

1. הכנת ננו-חלקיקים המחקים NGF HDL

1. ממיסים את חומרי העזר, פוספטידילכולין (PC), ספינגומיאלין (SM), פוספטידילסרין (PS), כולסטריל אולאט (CO) ו-D-α-טוקופריל פוליאתילן גליקול סוקסינט (TPGS), באתנול להכנת תמיסות מלאי ב-1 מ"ג/מ"ל.
   הערה: תמיסות המלאי נקבעו ואוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס. הכולסטריל אולאט אוחסן בבקבוקים כהים. פתרונות מלאי PC, SM, PS ו-CO היו יציבים עד 6, 3, 12 ו-12 חודשים, בהתאמה, ב-20 מעלות צלזיוס. תמיסת ה-TPGS הייתה יציבה במשך 12 חודשים לפחות ב-20 מעלות צלזיוס.
2. מערבבים 10 מיקרוליטר של NGF (1 מ"ג/מ"ל במים) עם 10 מיקרוליטר של פרוטמין USP (1 מ"ג/מ"ל במים) בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ונותנים לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ליצירת הקומפלקס.
   הערה: תמיסות מלאי ה-NGF והפרוטמין נקבעו ואוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס. הקפאה והפשרה חוזרות אינן מומלצות עבור מלאי ה-NGF.
3. הוסף לבקבוקון זכוכית 59 μL של PC, 11 μL של SM, 4 μL של PS, 15 μL של CO ו-45 μL של TPGS. מערבבים ומאדים את האתנול מתחת לזרם חנקן עדין למשך כ -5 דקות; כל חומרי העזר צריכים ליצור סרט שומני ודק בתחתית בקבוקון הזכוכית.
4. הוסף 1 מ"ל של מים טהורים במיוחד (סוג 1) לבקבוקון והומוגניזציה ב-9,500 סל"ד (8,600 x גרם) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את אב הטיפוס של ננו-חלקיקים (NPs).
5. מוסיפים את הקומפלקס שהוכן בשלב 1.2 לאב הטיפוס NPs ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך ערבוב באמצעות מוט ערבוב קטן בבקבוקון הזכוכית.
6. מצננים את ה- NPs על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות. לאחר שזה מתקרר, הוסיפו 106 מיקרוליטר של Apo A-I (1.49 מ"ג/מ"ל) וערבבו בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי ליצור את ה-NPs הסופיים המחקים NGF HDL.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-a-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, ביצה, עוף
ספינגומיאלין (SM)	Avanti	860062P	מוח, חזיר
פוספטידילסרין (PS)	Avanti	840032P	מוח, חזיר
כולסטריל אולאט (CO)	Sigma	C9253
D-α-טוקופריל פוליאתילן גליקול סוקסינט (TPGS)	BASF	9002-96-4	ויטמין E פוליאתילן גליקול סוקסינט
פרוטמין סולפט	Sigma	P3369	עומד במפרטי
בדיקת USPאפוליפופרוטאין A1, פלזמה אנושית	אתונה מחקר וטכנולוגיה	16-16-120101	1 מ"ג ב-671 מיקרוליטר 10 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.4
הומוגנייזר	Tekmar T	25-S1
הומוגנייזר פוליטרון	קינמטיקה	PT 1200C