כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הזרקת גורמי תכנות מחדש
- לתוך מערך חיות המוח, מיקום סטריאוטקסי וקידוחהערה: פרוטוקול זה מתמקד בשימוש ב-Ascl1, Lmx1a ו-Nurr1 (ALN) לתכנות מחדש של גליה NG2 (Neuron-Glial Antigen 2) לתוך אינטרנוירונים. מניסיוננו, ניתן להשיג אינטרנוירונים של פנוטיפ דומה באמצעות שילובי גורמים אחרים
- הזז את זרוע M/L-D/V של המסגרת הסטריאוטקסית למקומה (מעל החיה) ואבטח אותה.
הערה: המסגרת הסטריאוטקסית מאפשרת התאמה של המזרק לאורך הקדמי/אחורי (ציר A/P, Y), מדיאלי/רוחבי (ציר M/L, X), וציר הגב/גחון (ציר D/V, Z). - הזז את המזרק לאורך הציר השונה של המסגרת הסטריאוטקסית כדי להביא את קצה נימי הזכוכית ממש מעל ברגמה (נקודת הצומת שבה נפגשות לוחות הגולגולת השונים).
- ודא שהקצה הנימי ישר לחלוטין הן במישורי A/P והן במישורי M/L. במקרה של ברגמה מעורפלת, קח את הממוצע של התפרים הרוחביים וקו האמצע.
- כאשר קצה הנימים ממוקם כהלכה מעל הברגמה, אפס את ערכי ה-M/L וה-A/P ל-0.0 במונה הקואורדינטות הדיגיטלי.
- כדי לוודא שראש החיה נמצא במצב שטוח לחלוטין, השתמש במונה הקואורדינטות הדיגיטלי כדי למדוד את ערך הקואורדינטות D/V כאשר זרוע ה-A/P נמצאת ב-+2.0 ו-2.0 (M/L = 0.0), כמו גם כאשר זרוע M/L נמצאת ב-+2.0 ו-2.0 (A/P = 0.0). התאם את גובה מוט השיניים ומוטות האוזניים בהתאם.
- הזיזו את המזרק לקואורדינטות הרצויות להזרקת וקטורים נגיפיים בסטריאטום (A/P = +1.0; M/L = -2.0, יחסית לברגמה).
- הרימו מעט את המזרק, ועל ידי התבוננות באתר ההזרקה דרך המיקרוסקופ, קדחו חור באמצעות מקדחה דנטלית בקואורדינטות ההזרקה. התחל לקדוח באתר, לעבוד בצורה מעגלית ועדינה.
הערה: אל תפעיל יותר מדי לחץ כלפי מטה, מכיוון שהמקדח צריך להיות חד מספיק כדי לעבור דרך העצם ללא כוח נוסף. הימנע מקידוחים ארוכים ומתמשכים מכיוון שהדבר יוצר חום. - בתום הקידוח יש לבדוק שהדורה מאטר נשארת שלמה וחשופה להזרקה.
- הכנת הגדרת המזרק
- הניחו חתיכת גזה מכותנה על החתך הפתוח ושטפו את המזרק בתמיסת מלח.
- לאחר השטיפה, קחו בועת אוויר של 1-2 מיקרוליטר, ואחריה 1 מיקרוליטר של תמיסה המכילה את הווקטורים הנגיפיים, והימנעו מבועות לא מכוונות. ודא שניתן לדמיין בקלות את התמיסה הנגיפית מתחת לבועת האוויר, תוך כדי הזרקה.
- הזרקה ויראלית
- הסר את גזה הכותנה מעל מקום החתך, והורד את המזרק באמצעות זרוע D/V של המסגרת הסטריאוטקסית. כאשר מתקרבים לפני הגולגולת, הסתכלו בזהירות דרך המיקרוסקופ ומדדו את רמת ה-D/V של הדורה מאטר - היא אמורה להתנפח מעט בלחץ עדין.
- תוך כדי נגיעה בדורה מאטר עם קצה הנימים, הגדר את קואורדינטת D/V ל-0.0.
- הורד את המזרק, והתקדם לאט לעומק הרצוי (D/V = -2.7, ביחס לדורה מאטר). ודא שהמסלול נקי משברי עצם, כך שלא נצפה כיפוף של המחט/נימי.
הערה: הקואורדינטות המוצגות מתייחסות להזרקה של גורמי התכנות מחדש לסטריאטום של עכברי NG2-Cre. ניתן להשתמש בקואורדינטות המתאימות לאזורים אחרים במוח. בדוק תמיד את הקואורדינטות להזרקה תחילה באמצעות צבע (למשל, כחול טריפאן), הזרקת חרוזים צבעוניים או וקטור ויראלי מדווח לפני הזרקת גורמי תכנות מחדש למוח של זן עכבר חדש. אם מזריקים טריפן כחול, יש להקריב את החיות מיד לאחר הניתוח, ולנתח את המוח. ניתן לחתוך מוחות טריים באמצעות מיקרוטום, בעודם קפואים, ומקום ההזרקה נקבע על ידי הדמיה של מיקום הצבע במוח. אם בודקים קואורדינטות באמצעות חרוזים צבעוניים, ניתן לקבוע את מקום ההזרקה על מוחות חתוך וחתוך שבוע לאחר ההזרקה. לחלופין, ניתן להשתמש בזריקה עם וקטור ויראלי הנושא גן מדווח, ולקבוע את מיקום ההזרקה במוח חתוך. - יש להזריק 1 מיקרוליטר מהתמיסה הנגיפית בקצב של 0.4 מיקרוליטר לדקה. כאשר כל הנפח מוזרק, אפשר תקופת דיפוזיה של 2 דקות לפני נסיגת המזרק.
- לאחר הדיפוזיה, החזר לאט את המזרק עד שקצה הנימים יוצא לחלוטין מהמוח.
- הניחו חתיכת גזה כותנה על הפצע ושטפו את המזרק בתמיסת מלח.
- הזז את זרוע M/L-D/V של המסגרת הסטריאוטקסית מחוץ לאזור העבודה.
- סגירת פצע והליכים לאחר הניתוח
תפר - בזהירות את החתך באמצעות חוט תפרים.
הערה: יש להשליך את כל חוטי התפרים המשמשים בבעלי חיים מוזרקים בכוס/בקבוקון המכיל תמיסת ניקוי אנטי-ויראלית. אותו פתרון משמש לניקוי כל המשטחים המקיפים את אזור הניתוח שהיו במגע עם חומרים כירורגיים. כל כלי הניתוח נשטפים ביסודיות ועוברים חיטוי בסוף כל יום ניתוח. - הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותה בתחנה לאחר הניתוח, הכוללת כלוב נקי ומחומם, גישה למזון ומים, ושם החיה נשארת עד להתעוררות מלאה. במהלך תקופה זו, עקוב אחר בעל החיים מקרוב עד לחזרה להכרה.
- אין לשכן בעלי חיים מנותחים עם בעלי חיים שאינם מנותחים עד שהראשונים החלימו לחלוטין מהניתוח.
- השגיח על בעלי החיים המנותחים מדי יום. בהתאם לתפרים המשמשים, וודא שהם מוסרים במידת הצורך. כל בעלי החיים קיבלו Bupenorphinum (Temgesic במינון 1 מ"ל/ק"ג) תת עורית כטיפול לאחר הניתוח.
הערה: אם אתם משתמשים באותו מזרק במשך יומיים רצופים, יש לשטוף אותו במים, ולאחר מכן אתנול 70% ושוב מים. השאירו את המזרק מלא במים למשך הלילה כדי לאפשר פירוק של שאריות אפשריות.