אספקה אלקטרופורטית של GABA למוקד אפילפטי של עכבר מורדם

תקציר

מקור: Slezia, A. et al. אספקה אלקטרופורטית של חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA) למוקד אפילפטי מונעת התקפים בעכברים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את האספקה האלקטרופורטית של חומצה גמא-אמינו-בוטירית (GABA) כדי לעכב את פעילות ההתקפים בעכבר מורדם. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהשתלת בדיקה, רישום פעילות עצבית, השראת התקפים והעברת GABA מבוקרת באמצעות משאבת יונים מיקרופלואידית כדי להעריך את יעילותה הטיפולית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. ניתוח/קרניוטומיה

1. תקן את ראשו של עכבר מורדם במסגרת סטריאוטקסית. באמצעות מחט של 30 גרם, יש להזריק רופיווקאין משכך כאבים מקומי (5 מיקרוליטר, 7.5 מ"ג/מ"ל, ראה טבלת חומרים) תת עורית באתר החתך המתוכנן. המתינו 5 דקות עד שהוא ייכנס לתוקף.
2. צור קו אמצע חתך ישר בעור מעל הגולגולת בעזרת אזמל. משוך בעדינות את העור לצדדים בעזרת מלקחיים עדינים והדק אותו הצידה בעזרת בולדוג סרפיין clamps כדי להשאיר את הגולגולת חשופה להמשך עבודה.
3. נקו את גולגולת הפאשיה בעזרת אזמל או כל כלי דומה. במקרה של דימום שטחי, הסר את הדם בעזרת צמר גפן או חתיכות קטנות של מגבת נייר.
4. קח בורג הארקה מצופה פוליסטירן סולפונאט (PEDOT:PSS) מצופה פוליסטירן סולפונאט (PEDOT:PSS) (גודל: #00, קוטר: 0.047 אינץ', אורך: 1/8 אינץ', ראה טבלת חומרים) עם חוט מולחם וחבר אותו עם מחבר לראש המגבר.
5. הרטיבו את הגולגולת באתר החור הרצוי וקדחו חור במהירות גבוהה באמצעות מקדח עדין ועגול (בקוטר 0.4 מ"מ) על הגולגולת מעל המוח הקטן עד שהדורה נראית לעין. הכניסו את בורג הקרקע לחור והבריגו אותו בעזרת מברג מדויק עד שהוא מגיע לראש המוח הקטן.
   הערה: בורג הראש היה מצופה בתמיסת PEDOT:PSS המכילה 1% 3-גליצידילוקסיפרופיל)טרימתוקסילן (GOPS) לפי משקל ולאחר מכן אפייה ב-140 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. PEDOT:PSS הוא פולימר מצומד בעל קיבול נפחי הידוע כתואם ביולוגית. GOPS הוא מקשר צולב מעורבב עם PEDOT:PSS כדי להגביר את היציבות במדיה מימית (איור 1).
6. בעזרת המסגרת הסטריאוטקסית, מדוד את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות לאזור המוח הרצוי. לדוגמה, אזור העניין הוא ההיפוקמפוס, האנטרופוסטריור (AP) -1.8 מ"מ והמדיולטרלי (ML) 1.8 מ"מ מנקודת ברגמה בהתבסס על אטלס המוח לעכברים.
   הערה: אלה קואורדינטות עבור ההמיספרה הימנית (איור 1).
7. דק שטח בקוטר של כ-1 עד 2 מ"מ של הגולגולת מעל אזור היעד באמצעות מקדחה דנטלית אמינה (ראה טבלת חומרים) המכוונת במהירות גבוהה עד שנותר קרום עצם דק, מלוטש היטב ושקוף.
8. לאחר מכן, אם עובי קרום העצם דק מספיק (<200 מיקרומטר), צרו חור קטן בעזרת מלקחיים דקים והסירו בעדינות את השכבה הדקה של העצם. השתמש במחט עם קצה וו בהתאמה אישית כדי להסיר את הדורה. צמצמו את גודל הגולגולת והדורוטומיה כדי למנוע התפתחות של בצקות וכדי למזער את פעימות הלב ו/או הנשימה של המוח.
   הערה: יש למלא את הגולגולת בטיפה של תמיסת מלח כדי למנוע התייבשות, ולאחר מכן למלא אותה באופן קבוע במהלך הניסוי (איור 1).

2. החדרת בדיקת הסיליקון הרב-ערוצית

1. השתמש בזרועות סטריאוטקסיות בזווית AP קלה (20°) כדי שבדיקת הסיליקון תשאיר מקום רב למיקום של שני השתלים האחרים וכדי שאתרי ההקלטה וההזרקה של האלקטרודה, משאבת היונים והמיקרופיפטה יהיו קרובים ככל האפשר.
   הערה: אלקטרודות, מזרקים ומשאבות יונים כוסו בטיפה של תמיסת כתמים DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate [DiI]), להדמיה פוסט-הוק של עקבות ההשתלה (0.5 מ"ג/מ"ל DiI בדימתיל סולפוקסיד).
2. הנח את בדיקת הסיליקון על הזרוע הסטריאוטקסית המחוברת למחזיק מגנטי והנח אותה ליד המסגרת הסטריאוטקסית. הגדר את זווית ה-AP (20°) ולאחר מכן חבר את הגשושית לראש ה-stage ולבורג ההארקה.
3. הורד לאט את בדיקת הסיליקון לתוך ההיפוקמפוס בעזרת הזרוע הסטריאוטקסית המדויקת למיקרון או מיקרומניפולטור ממונע כדי למנוע תנועות רוחביות (איור 1 ואיור 2).
   1. הפעל את תוכנת ההקלטה והקלט - עם הבמה הראשית, המגבר המחובר ומחשב - אותות עצביים חשמליים תוך הזזת בדיקת הסיליקון הרב-ערוצית מהחלק העליון של קליפת המוח עד להגעה למיקום הדורסובנטרלי (DV) הממוקד (-1,800 מיקרומטר מהמשטח הקורטיקלי). הקלט וצפה באות פוטנציאל השדה המקומי (LFP) במהלך החדירה על מסך המחשב.
      הערה: שלוט בירידה של הגשושית כך שהיא נעה לאט וברציפות בזמן ההקלטה, כדי לקבל שליטה חזותית טובה יותר על החדירה ועל ההגעה לאזור המטרה.
   2. השתמש בפעילות האדווה בשכבה הפירמידלית של תצורת ההיפוקמפוס ב-LFP המוקלט כסמן של אזור המטרה.
      הערה: פעילות אדווה נראית בערוץ אחד או שניים שכנים של גשושית הסיליקון הרב-ערוצית (Si) עם מרחק של 100 מיקרומטר בין אתרי הקלטה (איור 3).
   3. הקלט אותות LFP משכבות קליפת המוח וההיפוקמפוס בו-זמנית באמצעות תוכנת המגבר הרב-ערוצי (ראה טבלת חומרים) בעזרת בדיקות Si רב-ערוציות (איור 3).

3. החדרת משאבת יונים מיקרופלואידית (μFIP)

1. חבר צינורות (ראה טבלת חומרים) לכניסה של ה-μFIP ומלא את הגשושית בתמיסת חומצה גמא-אמינו-בוטירית (GABA) של 0.05 M. הסר את הצינורות וסגור את הכניסה בעטיפת סרט פרפין. חבר כבלי חשמל ליחידת מדידת המקור.
2. הכנס את ה-μFIP בעזרת הזרוע הסטריאוטקסית בזווית בינונית (MP) (20°). בדיקת ה-Si נשארת מוכנסת במהלך כל התהליך.
   הערה: μFIP גמיש מאוד ועשוי להפיק תועלת מתמיכה של מברשת קטנה ונקייה כדי לשמור אותה ישרה עד שהיא מגיעה לפני השטח של המוח. לאחר שלב זה, ניתן להוריד את μFIP בעדינות בתנועות ציריות.
3. הורד את ה-μFIP לאט בתנועות ציריות ולעולם אל תיתן לו להתכופף במהלך המסלול עד שהוא מגיע לקואורדינטה הדורסוובנטרלית (DV) (-1,200 מיקרומטר מהמשטח הקורטיקלי).
   הערה: נסה למקם את שני המכשירים (μFIP ובדיקת סיליקון) קרוב ככל האפשר זה לזה, בהתחשב במרחק של 300 מיקרומטר של היציאה מקצה ה-μFIP.
   זהירות: הימנעו מבעיות מכניות כלשהן בין ההתקנים והמחברים שלהם במהלך ההחדרה (איור 1B ואיור 2B).

4. הכנת מכשירים לאינדוקציה של התקפים

1. החלף את מחט המתכת של המזרק (10 מיקרוליטר) (ראה טבלת חומרים). הסר את חלק המתכת המחזיק מחט, הנח וקבע את המיקרופיפטה (קוטר חיצוני [OD]: 1.2 מ"מ, קוטר פנימי [ID]: 0.75 מ"מ, קוטר קצה: 20-50 מיקרומטר עם ± 0.5 ס"מ של התחדדות של השוק), ולאחר מכן החלף את אלמנט החזקת המחט.
2. מקם את המזרק ואת המיקרופיפטה הבורוסיליקט המחוברת בזווית של 20° lateromedial (LM) להזרקה של 4-aminopyridine (4AP) (50 מ"מ בנוזל מוחי מלאכותי [ACSF]).
   זהירות: אין להשתמש במחט המתכת של המזרק או במיקרופיפטה עם קצה גדול מ-50 מיקרומטר.
3. צייר 500 nL-1 μL של 50 מ"מ 4AP בעזרת משאבת מיקרו-הזרקה אוטומטית.

5. החדרת פיפטת הזכוכית המחוברת למזרק להזרקת 4AP

1. הורד את המיקרופיפטה הזכוכית המחוברת למזרק למצב ה-DV המכוון (-1,500 מיקרומטר), ולאחר מכן הזריק 250 נ"ל מתמיסת 4AP (איור 1 ואיור 2). התחל להקליט עם תוכנת ההקלטה. צפו במסך והמתינו להופעת הספייק הביניים הראשון.
2. התחל את אספקת ה-GABA על ידי μFIP מיד עם הופעת הספייק הביניים הראשון. ספק GABA על ידי החלת 1 V בין המקור ליעד למשך 100 שניות ואחריו 1 שניות כבוי למשך 30 מחזורים. בעזרת תוכנת ההקלטה, הקליטו למינימום של 2 שעות
   הערה: המסה הכוללת של ה-GABA המסופק היא בסביבות 1 ננומול (איור 4).
3. בסוף הניסוי, הסר בעדינות את הבדיקות שהוכנסו ואת בורג ההארקה, והסר את החיה מהציוד הסטריאוטקסי. בעלי חיים הומתו באמצעות מנת יתר של תרופה (100 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל). המוות אושר על ידי הפסקת הנשימה וזרימת הדם.

תוצאות

איור 1: קרניו-דורוטומיה ולוקליזציה של השתלים במוח העכבר. (A) מבט סכמטי על הניתוח, על הגולגולת ועל המטרה של השתלים במוח העכבר. (B) השתמשו בקואורדינטות ובזוויות סטריאוטקסיות להשתלת שלושת המכשירים. μFIP = 20° מדי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4AP	מגבר Sigma	275875
	Neuralynx, מונטנה, ארה"ב	מגבר מגבר Digital Lynx 4SX
		KJE-1001
Atlas Stereotaxique	אלן אטלס	978-0470054086
פיפטת זכוכית בורוסיליקה	סאטר	BF120-69-15
מטריצת מוח	WPI	RBMA-200C
גוזם עצם	FST	16109-14
מחבר	INSTECH	SC20/15
קוטון	טיג מונופריקס	EMD 6107OD
תלוש כיסוי	מנזל-זכוכית	15747592
DiI כתמים	תרמו פישר	D282
DMSO	Sigma	11412-11
מקדחה	FOREDOM	K1070
מלקחיים	FST	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GOPS	Sigma	440167-100M
מזרק המילטון	המילטון	80330
אספקת רכיבי	בורג	ראש TX00-2FH
כרית חימום	מכשיר הרווארד	341446
משאבת	הזרקהWPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
קטמין	Renaudin	5787419
מחזיק מגנטי	Narishige	GJ-1
עכברים	צ'ארלס ריבר	612
מניפולטור מוטורי	Scientifica, בריטניה	IVM
דיסודיום מימן פוספט	סיגמא	255793
מונוסודיום דימימן פוספט	סיגמא	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
מגבת נייר	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS		81076212
PFA	Acros אורגני	30525-89-4
בדיקת טמפרטורה רקטלית	מכשיר הרווארד	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
מלח	סיגמא	7982
אזמל	F.S.T	AUST
Seringue	BD 324826 רפואי
מהדק Serrefine	FST	18050-28	4 מומלץ
בדיקת סיליקון	NeuroNexus, מישיגן, ארה"ב	A2x16-10mm-50-500-177 או A1x16-5mm-150-703
מסגרת סטריאוטוקסית	Stoelting	51733U
קסילזין	באייר	4007221032311

R195806