אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

סיכום

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

תקציר

כמו וקטורים פלסמיד סטנדרטיים, ניתן transfect lentivectors בצורת פלסמיד לתאים בעלי יעילות נמוכה עד בינוני לקבל ביטוי חולף של effectors. Lentiviral אריזה ביטוי בונה לחלקיקים pseudoviral, לעומת זאת, מאפשר התמרה של עד 100%, גם אם קשות transfect תאים, כגון גזע, העיקרי, ותאי הבדיל. יתר על כן, משלוח lentiviral אינו מייצר את התגובות סלולריות ספציפיות הקשורות בדרך כלל transfections כימיים, כגון מוות של תאים כתוצאה רעילות של מגיב transfection ^{1, 2.} כאשר transduced לתאי יעד, מבנה lentiviral משתלב הדנ"א הגנומי ומספק ביטוי יציב של סיכת ראש RNA קטן (shRNA), microRNA cDNA, או עיתונאי גן ^{3, 4.} תאים היעד ביציבות המבטאים את המולקולה מפעיל ניתן לבודד באמצעות סמן לבחירה הכלול וקטור ביטוי לבנות כגון puromycin או GFP. לאחר PSחלקיקים eudoviral להדביק תאים היעד, הם לא יכולים לשכפל בתוך תאים היעד בגלל הגנים המבניים ויראלי נעדרים ואת חוזרת מסוף ארוכות (LTRs) נועדו להיות עצמי inactivating על התמרה ^{5, 6.}

ישנם שלושה מרכיבים עיקריים הדרושים אריזה lentiviral יעיל ^{1, 5, 6, 7.}

1. וקטור ביטוי lentiviral המכיל כמה מרכיבים גנטיים הדרושים האריזה, שילוב יציב של הביטוי ויראלי לבנות לתוך הדנ"א הגנומי, וביטוי של מפעיל או עיתונאי.
2. על פלסמידים אריזה lentiviral המספקים את החלבונים החיוניים שעתוק ואריזה של עותק RNA של הביטוי לבנות לתוך רקומביננטי חלקיקים pseudoviral. פרוטוקול זה משתמש פלסמידים pPACK (SBI) המקודדים על איסור פרסום, pol, ו rev מן הגנום HIV או FIV וחלבון שלפוחי דלקת בפה גרם וירוס (VSV-G) של חלבון מעיל ויראלי.
3. 293TN לייצר R-תאים (נגזר HEK293 תאים) המבטאים את האנטיגן SV40 T גדול, אשר נדרש לצורך ייצור גבוהה titer lentiviral ואת הגן התנגדות neomycin, שימושי שתבחר מחדש את התאים לצורך תחזוקה.

סקירה כללית של פרוטוקול ייצור ויראלי ניתן לראות באיור 1. הייצור הנגיפי מתחיל שיתוף transfecting תאים המפיק 293TN עם וקטור ביטוי lentiviral ואת פלסמידים אריזה. חלקיקים נגיפיים מופרשים אל התקשורת. לאחר 48-72 שעות של תרבות התקשורת סלולריים נאסף. פסולת נייד יוסר התקשורת תרבית תאים, ואת חלקיקים נגיפיים הם זירז ידי צנטריפוגה עם PEG-IT ריכוז. חלקיקים lentiviral המיוצרים הם titered אז ניתן transduce תאים היעד. פרטי titering ויראלי אינם נכללים בפרוטוקול זה, אך ניתן למצוא בכתובת:

ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

פרוטוקול זה בצורה מיטבית באמצעות מוצרים ספציפיים המצוינים. חומרים כימיים אחרים עשויים להיות תחליף, אבל את אותן תוצאות לא ניתן להבטיח.

פרוטוקול

1. Transfection של תאים 293TN עם פלסמידים אריזה והביטוי לבנות

1. זרע 7.0-8.0 x 10 ⁶ תאים 293TN בכל צלחת ² 15 תרבות ס"מ 20 מ"ל של מדיום תרבות המכיל בינוני DMEM השלימו עם 4 מ"מ L-גלוטמין, 4.5 גר '/ ליטר גלוקוז בדם העובר שור (10%) ללא אנטיביוטיקה. לגדול במשך 18-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם CO 5% _2, כך צפיפות התאים מגיע ל 60-80% confluency בזמן transfection. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך צלחות זרעים שונים של תאים להשיג titer גבוהה מספיק עבור התמרה של תאים היעד.
2. על כל צלחת של תאים, להוסיף 1.6 מ"ל סרום ללא DMEM כדי צינור autoclaved 2 Eppendorff מ"ל. הוסף 45 μl pPACKH1 מיקרוגרם או pPACKF1 ו -4.5 של lentivector שלך כדי לבנות DMEM ומערבבים ידי pipetting מעלה ומטה.
3. הוסף 55 μl של PureFection לתוך צינור אחד. מערבולת למשך 10 שניות. דגירה את התערובת-פלסמיד-PureFection DMEM ב F בטמפרטורת החדראו 15 דקות.
4. מוסיפים את תערובת-פלסמיד-PureFection DMEM לצלחת רקמת התרבות נפתח חכם מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה לאורך כל הצלחת. להחזיר את התבשיל כדי חממה לגדול ב 37 ° C עם 5% CO _2.
5. אין צורך לשנות את התקשורת לאחר transfection. אם מבנה lentivector שלך מבטא את הגן המקודד חלבון פלואורסצנטי כמו ה-GFP, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ 12-24 שעות לאחר transfection. אתה אמור להיות מסוגל לראות> תאים 90% GFP חיובי, המעיד על כך transfection הצליחה.
6. איסוף תרבית תאים supernatant לאחר 48 ו - 72 שעות אל תוך צינור 50 צנטריפוגות סטרילית מ"ל. זה supernatant תרבית תאים כעת מכיל חלקיקים pseudoviral זיהומיות. (פעל על פי ההנחיות המומלצות לעבודה עם דרגת הגנה BSL-2.) צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה פסולת הסלולר. העברת supernatant ויראלי צינור חדש, על מנת להבטיח שלא להפריע גלולה.
7. תאים 293TN שנוצלו על האריזה ויראלי צריך להיות מסולק במיכל Biohazard ואינם לשמש סבב נוסף של אריזות ויראלי.

2. ריכוז Supernatant ויראלי

1. הוסף 1 נפח קר (4 מעלות צלזיוס) PEG-IT רטיבות וירוס פתרון כל 4 כרכים של supernatant חלקיק המכיל lentiviral. משקעים של חלקיקים lentiviral של כמויות גדולות ניתן להשיג עם קורנינג 250 מ"ל צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן. מערבבים את הפתרון על ידי פעמים צינורות היפוך מספר, אבל אל מערבולת את התערובת.
2. מקררים את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 שעות (עד 4 ימים מקובל). לא ללחוץ או לסובב את הצינורות במהלך שלב הקירור.
3. בצנטריפוגה תערובת supernatant / PEG-IT ב 1500 XG במשך 30 דקות 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, חלקיקים lentiviral יופיע בצבע בז' או לבן גלולה בחלק התחתון של הצינור. יוצקים את supernataNT.
4. הסר את כל עקבות של נוזלים על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את חלקיקי lentiviral שזירזו ב גלולה. עקבות של שיורי-PEG יהיה לדלל את הנגיף (ובכך להקטין את titer), אך לא ישפיע על שלמות התאים היעד מאז PEG-IT הוא אינרטי ולא רעיל.
5. Resuspend ולשלב את חלקיקי lentiviral ב 1/100 של נפח המקורי באמצעות קר (4 מעלות צלזיוס), פוספט סטרילית שנאגרו מלוחים או DMEM המכיל 25 HEPES חוצץ מ"מ.
6. Aliquot לתוך צלוחיות קריוגני סטריליים החנויות ב -70 ° C עד מוכן לשימוש.

3. Titering פרידמן וקיבל הד עולמי ויראלי של תאים היעד

1. אנו ממליצים titering חלקיקים lentiviral לפני transducing היעד תאים של ריבית וחישוב ריבוי הולם של זיהום (משרד הפנים) על התאים היעד עבור עקביות בין הניסויים. עבור titering ויראלי, מומלץ להשתמש HT1080 תאים כקו קל להדביק חיובית שליטה. Plלהקל לציין כי פרוטוקול titering כרוך transducing HT1080 תאים עם aliquot קטן של חלקיקים lentiviral לך ארוזים. לאחר titer ידוע, היעד תאים של ריבית ניתן transduced עם חלקיקים lentiviral המיוצרים. פרוטוקול ממליצים titering ניתן למצוא בכתובת: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. 50,000 פלייט היעד תאים של ריבית לכל גם בצלחת 24 גם בתקשורת תרבית תאים. השתמש בתקשורת כי תאים בתרבית בדרך כלל פנימה לגדול בתאים לילה בתנאים שצוינו תרבותם. תאים צריכים להיות בין 50 עד 70% confluent ביום התמרה.
3. ביום של התמרה, לשאוב את התקשורת מן התאים. שלב בינוני תרבות עם TransDux לריכוז x 1 הסופי (לדוגמה, 2.5 TransDux μl עד 500 μl של המדיום תרבות). לאחר מכן להעביר את TransDux-CE תרבות LL בינוני התערובת היטב כל אחד מהם.
4. פיפטה בנפח מתאים של וירוס אשר תואמים את האופטימלי עבור משרד הפנים את התאים לתוך היעד גם כל אחד. אם משרד הפנים האופטימלי אינו ידוע, מומלץ לנסות את מגוון MOIs שונים (כגון משרד הפנים של 1, 2 ו - 5 עבור קל להדביק התרבות תאים ורקמות, ועל משרד הפנים של 1, 10 ו 20 יותר קשות , להדביק תאים ראשוניים). אם ריכוז של חלקיקים lentiviral לא ידוע (כפי שנקבע באמצעות פרוטוקול titering וירוס), כמויות שונות של הנגיף יכול להישפט, כגון μl 1, 2 ו - 5 של הנגיף. הווירוס יכול להישאר בקשר עם התאים היעד של עד 72 שעות.
5. ניסויים נוספים עם transduced תאים של ריבית היעד רשאי להגיש 72 שעות לאחר התמרה, פעם מבנה ויראלי שילבה לתוך הגנום של התא המארח. שנה בינונית מעבר היעד תאים של ריבית על פי הצרכים הספציפיים שלהם.

4. נציג תוצאות

= "jove_step" המעמד> transfection של תאים 293TN

צפיפות המוצא של התאים 293TN הוא קריטי עבור אריזה ויראלי מוצלח. תאים 293TN חייב להיות בין 60% -80 confluent יום transfection (איור 2). אם התאים 293TN פחות מ confluent 60%, לאפשר להם לגדול במשך עוד כמה שעות לפני שתנסה transfection. אם התאים הם 293TN> confluent 80%, הם צריכים להיות replated לפני transfection.

אם באמצעות ה-GFP להביע lentivector, לפחות 90% מהתאים 293TN צריך לזרוח ירוקים 24 שעות לאחר transfection, המציין transfection מוצלחת (איור 3). אם פחות מ 90% מכלל התאים GFP חיובי, לא להמשיך לשלב הבא, כי זה מצביע על כך transfection לא היה מוצלח, ואת titers ויראלי יהיה נמוך. במקום זאת, תאים חדשים צלחת 293TN ולהתחיל מחדש, כדי לוודא שהתאים 293TN הם בצפיפות תאים תקינה לפני transfecting.

תאים 293TN יכול לשלוף את תרבות צלחות רקמות 48-72 שעות לאחר transfection. זה לא להשפיע לרעה על ייצור של חלקיקים lentiviral.

Titering עם HT1080 תאים

Titers ויראלי יכול להיות מחושב באמצעות ערכת Titering UltraRapid גלובלי של SBI על פי הוראות היצרן. מערכת זו עושה שימוש QPCR למדוד ויראלי שילוב של רצף wpre מ וקטור lentiviral אל HT1080 תאים ומשווה את זה עקום רגיל, המבוסס על רצף הגנום התייחסות כדי למדוד במדויק את יחידות זיהומיות לכל מ"ל (איור 4).

התמרה של תאים היעד

אם אתה משתמש חלקיקים lentiviral המבטאים סמן GFP פעיל constitutively, תאים GFP חיוביים צריך להתחיל להופיע בתוך 12-24 שעות של התמרה, אם התגובה התמרה עובד. ביטוי של GFP יש להמשיך אחרי מבנה lentiviral ביציבות משתלב לאהוא לארח בגנום התא. אם transducing עם MOIs שונים, הקרינה GFP יש כ להתאים את משרד הפנים, שם MOIs נמוכות להראות הקרינה GFP פחות MOIs גבוהות יותר להראות עלייה GFP הקרינה (איור 5).

באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול ייצור ויראלי. פלסמידים את האריזה lentivector ו pPACK מעורבות ושיתוף transfected לתאי 293TN. לאחר 48 -72 שעות, supernatant ויראלי נאסף, ואת חלקיקים נגיפיים הם זירז עם PEG-IT. לאחר titering חלקיקים lentiviral, הם יכולים לשמש transduce היעד תאים של ריבית. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

2. איור שלב לעומת זאת התמונה של תאים 293TN. תא densitY צריך להיות בין 60-80% confluent יום transfection.

איור 3. תמונת הניאון של תאים GFP חיובי 293TN 24 שעות לאחר transfection עם Purefection, pPACKH1, ו-GFP קידוד lentivector לבנות.

איור 4. תוצאות wpre QPCR ואת עקומת סטנדרט להשיג באמצעות ערכת Titering UltraRapid גלובלי של SBI לחשב משרד הפנים ו titer המקביל חלקיקים נגיפיים ארוזים.

איור 5. תמונות של פלורסנט HT1080 תאים transduced עם כמויות הולכות וגדלות של lentivirus. התמונות הן מ 72 שעות לאחר התמרה.

דיון

אריזה זה ויראלי התמרה של פרוטוקול היעד תאים כבר מותאם לשימוש עם חומרים כימיים ויראלי של SBI אריזה. החלפת חומרים כימיים אחרים עשויים להשפיע על התוצאה של הפרוטוקול. פרוטוקול זה רק בצורה מיטבית לייצור lentiviral ולא מתאים לייצור סוגים אחרים של וירוסים או pseudoviruses.

אריזה ויראלי מוצלח תלוי צעדים מרכזיים. התאים 293TN לבטא את האנטיגן SV40 T גדול, שהוא הכרחי הפרשת חלקיקים לתוך lentiviral supernatant תרבית תאים. הצפיפות שבה התאים הם 293TN בזמן transfection חשוב במיוחד על מנת מגיב PureFection מספיק כדי להעביר את lentivector ו פלסמידים אריזה לתוך התאים. הוספת תערובת PureFection לצלחת רקמת התרבות בצורה טיפה מבחינת ואחריו ביסודיות מתערבל צלחת חשוב פיזור של פלסמידים אריזהו lentivector לבנות לאורך כל התאים. אי הולם לחלק את הווקטורים עלול לגרום חלקיקים lentiviral מספיק שיופקו. התגובה אריזה ויראלי יכול להיות scaled עד לייצור של וירוס כייל גבוה, המבוסס על שטח הפנים של צלחות תרבית הרקמה. אפשר לבחור כמה צלחת רקמות מנות התרבות של תאים 293TN לכל מבנה זה צריך להיות ארוז. ריכוז של supernatants ויראלי יעיל במיוחד ביצירת גבוהה כייל הנגיף. Supernatant ויראלי מצלחות רבות של תאים ניתן לשלב והתרכז לשימוש בניסויים vivo, או תאים שקשה transduce.

Titering חלקיקים lentiviral המיוצרים חשוב לחישוב מדויק משרד הפנים להשתמש עבור התמרה של תאים היעד. לדעת משרד הפנים ששימש התמרה נתון מאפשר פתרון בעיות במקרה של התמרה לא הצליחה. לדוגמה, באמצעות משרד הפנים, כי הואנמוך מדי עלול לגרום לתאי מטרה מעט מאוד המבטאים את המבנה של ריבית. באמצעות משרד הפנים, כי הוא גבוה מדי, לעומת זאת, עלול לגרום לתאי מטרה המראים סימנים של לחץ. המטרה היא להשתמש למיקסום משרד הפנים הבעת עניין של מבנה, תוך שמירה על בריאותם של התאים. למרות שאנו ממליצים על פרוטוקול QPCR מבוסס titering המודד עותקים משולבת של מבנה lentiviral ב HT1080 תאים, גישות titering אחרים יכולים לשמש, כגון ELISA p24 או הערכה של אחוז ה-GFP חיובי תאים.

התמרה מוצלח של תאים היעד תלוי גם בגורמים מרכזיים. TransDux הוא מגיב זיהום ייחודית המאפשרת יעילות התמרה גבוהים, אבל זה לא רעיל לתאים. TransDux יכול לשמש במקום polybrene, אשר לעיתים קרובות רעילים לתאי המטרה. הכללת TransDux ב התמרה של תאים היעד עוזר לנטרל מטענים על חלקיקים נגיפיים ומאפשר את הנגיף לתאs. מאז TransDux אינו רעיל לתאים, ניתן לאפשר את חלקיקי lentiviral להישאר בקשר עם התאים לתקופה של עד 72 שעות (הזמן שבו המבנים ויראלי השתלבו בגנום התא המאכסן), ובכך מגדילים את ההסתברות חלקיקים נגיפיים להיכנס לתא. כמה קשות transduce תאים, transductions ניתן לחזור יום אחר יום כדי להגביר את היעילות התמרה. לדוגמה, transduce התאים ביום 1, לאפשר התאים לנוח ביום 2 ולאחר מכן transduce התאים שוב ביום 3. חשוב להמתין 72 שעות לאחר התמרה אחרונה לפני תחילת הבחירה, ניסויים נוספים או אפיון של התאים היעד.

אריזה ויראלי יעיל הוא גם תלוי בגודל של מבנה lentiviral, בין 5 "אזורי 3'LTR. חלק זה של המבנה lentiviral צריך להיות כ 9 קילו או פחות, המתאימה לגודל של הגנום HIV הילידים. העולה על 9 KB מאי דהtiter קמט של חלקיקים pseudoviral המיוצרים. הטכנולוגיה החדשה, כמו וקטורים piggyBac transposon, לאפשר אינטגרציה, אמין ויציב של transgenes עד 100 kb דרך transfection אחד. גישה זו עשויה לשמש בונה כי יעלה את מגבלת הגודל עבור וקטורים lentiviral, במקרים בהם ניתן transfect תאים היעד, ומעניק יתרון נוסף של לא לדרוש צעד אריזה ויראלי ^9,10.

החלקיקים pseudoviral הופק באמצעות פרוטוקול זה הן זיהומיות בכך שהם יכולים להדביק תאים מסוגים יונקים ביותר. המוצרים בשימוש בפרוטוקול זה, עם זאת הם דור שלישי biosafe בכך שהם מייצרים replicative הלא עצמית inactivating pseudoviruses. לכן, ברגע transduced לתאי היעד או בעלי חיים, התאים היעד או בעלי חיים שאינם זיהומית או מדבקת. החלפה של פלסמידים lentivector אחרים שאינם דור שלישי biosafe אפשרי אם כי לא מומלץ מ biosafetyפרספקטיבה. פרוטוקול הייצור הנגיפי התמרה הבאות של תאים היעד צריכה להתבצע תחת רמת בטיחות ביולוגית 2, על פי הנחיות NIH ^11, וחוקרים תמיד צריך ללבוש חלוק מעבדה וכפפות בעת טיפול חלקיקים נגיפיים. בשימוש בתאי המפיק 293TN, צינורות של חלקיקים נגיפיים, וכן טפטפות חד פעמיים להשליך במיכל Biohazard המתאים. בטפי להחדרת נוזלים הניתנים לשימוש חוזר וכלי זכוכית צריך חיטוי עם אקונומיקה ו מעוקר כדי להקטין את החשיפה של אדם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
DMEM בינוני גלוקוז גבוהות	Gibco	11995-073
293TN תאים	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	ל-HIV מבוססי lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	עבור FIV מבוססי lentivectors
כל וקטור lentiviral	SBI	שונים	cDNA, shRNA, microRNA, שעתוק עיתונאים
PureFection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-IT	SBI	LV810A-1 LV825A-1
עולמי Titering UltraRapid ערכת	SBI	LV961A-1	לא תיאר בפרוטוקול זה, אבל צריך titer חלקיקים נגיפיים
TransDux	SBI	LV850A-1