הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

תקציר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הזרקה סטריאוטקסית

1. ודא שהאוורור לחדר הניתוחים פתוח כדי להבטיח זרימת אוויר תקינה. הכן את העכבר לניתוח על ידי הרדמתו עם איזופלורן 4% בתא אינדוקציה. לאחר ההרדמה, יש לגלח את הראש כדי להכין את מקום ההזרקה.
   1. הנח את העכבר במכשיר הסטריאוטקסי באמצעות פינצטה כדי להזיז את הלשון למטה ולצד. הכניסו את מוט הנשיכה לפה עד שהשיניים נופלות לתוך החריץ, ולאחר מכן אבטחו את מוטות האוזניים. ודא שגוף העכבר נמצא על כרית החימום והאף ממוקם בקונוס האף. יש לכוון 4% איזופלורן לתוך חרוט האף. אשר את ההרדמה על ידי צביטה של כף הרגל בפינצטה והקפדה על כך שאין רפלקס בהלה.
   2. מרחו דמעות מלאכותיות כדי לשמן את העיניים. סיים את הכנת מקום ההזרקה על ידי ספיגת הראש המגולח בסבבים לסירוגין של פובידון-יוד ולידוקאין.
2. בעזרת אזמל חותכים חתך קטן במרכז הקרקפת. יבש את הגולגולת עם ספוגית ומי חמצן במידת הצורך כדי לעזור לדמיין ברגמה.
   1. בעזרת טווח ניתוח, אתר את הברגמה על הגולגולת והנח את קצה המקדחה על הברגמה. אפס (או הקלט) את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות הדיגיטליות במישורי x, y ו-z.
   2. על מנת להבטיח שהראש יהיה מפולס על ציר ה-y הרוסטרלי לזנב, הנח את המקדח על למבדה ויישר את הראש כך שקואורדינטת ה-z תהיה שווה בערך גם בברגמה וגם בלמבדה.
   3. על מנת להבטיח שהראש ישר על ציר ה-x, הנח את המקדחה ב-y = 1/2 lambda. ודא שקואורדינטת z שווה ל-1 מ"מ מכל צד (x = +/-1 מ"מ) של התפר הסגיטלי. כוונן את הגולגולת אם יש הבדל בקואורדינטות z ב-1 מ"מ משמאל ומימין ללמבדה.
3. הנח את המקדחה מעל הקואורדינטות הרצויות. עבור הפיתול המשונן, השתמש בקואורדינטות y = -1.9 מברגמה ו- x = +/- 1.1. לפני הקידוח, הורד את האיזופלורן ל -2%, ואז קדח לאט ובזהירות דרך הגולגולת.
   1. לאחר קידוח כל החורים, הצמד את המזרק המלא למכשיר הסטריאוטקסי. מרכז חזותית את המזרק מעל החור ואפס את קואורדינטת z בגולגולת.
   2. הורד לאט את המזרק לעומק z העמוק ביותר. עבור הבליטה המשוננת, עומק z הוא -2.5, -2.4 ו-2.3. התחל בהזרקה בקצב של 0.25 מיקרוליטר לדקה באמצעות מזרק סטריאוטקסי.
      1. לאחר השלמת ההזרקה בעומק ה-Z הנמוך ביותר, המתן דקה אחת, ואז העלה לקואורדינטה הבאה והתחל שוב בהזרקה. המשך בדפוס זה עד להזרקת כל קואורדינטות הזרקת z. המתן 2 דקות לפני הוצאת המזרק לאחר ההזרקה האחרונה.
         הערה: לא נצפו תופעות לוואי על הרקמה על ידי הזרקת עד 2 מיקרוליטר של וירוס לכל חצי כדור במוח העכבר.
   3. חזור על ההזרקה עבור קידוחים אחרים.
4. לאחר ההזרקה, הסר את העכבר מהמכשיר הסטריאוטקסי ותפר את הקרקפת עם 6-0 תפרי משי. מרחו לידוקאין וקרם אנטי בקטריאלי על הפצע.
   1. להזריק 0.8-1.0 מ"ל מי מלח + קטופרופן (3-5 מ"ג/ק"ג) דרך המסלול התוך-צפקי (I.P.) לטיפול בכאב. לאחר מכן, הנח את העכבר בתא ההתאוששות המחומם. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על החזה. אין להחזיר את בעל החיים לחברת בעלי חיים אחרים עד שהוא מתאושש לחלוטין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Stereotaxic Surgery Reagents
וטרינר מזרק וטרינר משתמש במזרק T.B. רק 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
להבי אזמל נירוסטה, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
משחת דמעות מלאכותית	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
תמיסת מלח רגילה	Med-Vet International	DYND500MLSH
אפליקטורים עם קצה כותנה	Med-Vet International	CTA6
משחה אנטיביוטית משולשת	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® מחטים חבילה רכה 25 גרם x 5/8 אינץ'	Med-Vet International	25058
6-0 תפרי משי	Med-Vet International	MV-711