אספקת תרופות נוירותרפיוטיות מבוססות משאבה אוסמוטית במודל עכבר דמיאליני

תקציר

מקור: Wang, X. et al., אספקת תרופות מבוססת משאבה אוסמוטית למחקר רמיאלינציה in vivo על מערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השיטה למתן תרופות נוירותרפיוטיות באמצעות משאבה אוסמוטית במודל עכבר דמיאליני. שחרור התרופה המבוקר מקדם רמיאלינציה על ידי הפעלת תאים מייצרי מיאלין בקורפוס קלוסום.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הקמת מודל עכבר הדמיאלינציה המושרה על ידי ליזולציטין

1. הכינו תמיסת ליזולציטין 1% (נקראת גם L-α-Lysophosphatidylcholine) עם תמיסת מלח סטרילית עם פוספט (PBS).
2. עקר מספריים, מלקחיים, המוסטטים מעוקלים ומכשירים כירורגיים אחרים על ידי עיקור חיטוי. עקר את אזור הניתוח והניח יריעות סטריליות. יש להכין את כל החומרים והריאגנטים המשמשים לניתוח באופן אספטי. חשוב לשמור על אזור הניתוח סטרילי לאורך כל ההליך.
3. להרדים עכבר יום לאחר הלידה 56 (P56) C57BL6 כדלקמן.
   1. הנח את העכבר בתא האיזופלורן של מכונת ההרדמה של בעלי חיים קטנים. כוונן את זרימת ה-O₂ ל-300-500 מ"ל/דקה ואת האיזופלורן ל-3%-4%. לאחר הרדמה מספקת, כאשר העכבר הופך לחסר תנועה בנשימה איטית ויציבה, העבירו את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי בעזרת כרית חימום.
   2. העבר את תפוקת הגז מהתא למסכת ההרדמה והתאם איזופלורן ל-1%-1.5% כדי לשמור על העכבר במצב הרדמה. המתן עד שהעכבר מורדם לחלוטין, ולאחר מכן הזריק קטופרופן (3-5 מ"ג/ק"ג) תוך צפקי כדי להקל על הכאב. לפני הניתוח, צבט את אצבעות העכבר ובדוק את תגובתו כדי לאשר הרדמה מוצלחת.
   3. כאשר העכבר מורדם הוא אינו יכול לווסת את טמפרטורת גופו. לכן, יש לפקח ולווסת את טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך הניתוח. כסו את פני גלגלי העיניים של העכבר במשחת עיניים אריתרומיצין כדי לשמור על לחות גלגלי העיניים בזמן ההרדמה.
4. אבטח את ראש העכבר במנגנון הסטריאוטקסי עם מוט שיניים ומוטות אוזניים. (איור 1A).
5. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר שיער מהחלק העליון של הראש. יש לחטא את עור הראש עם שלושה מחזורים של בטדין ו-75% אתנול. מטעמים אתיים, יש לכסות את גוף החיה למעט מקום הניתוח. באמצעות אזמל, עשו חתך באורך 1 ס"מ באמצע הסגיטלי של העור מבסיס הצוואר ועד בין העיניים כדי לחשוף את הגולגולת (איור 1B).
6. נגבו בעדינות את פני הגולגולת עם צמר גפן סטרילי המכיל 30% מי חמצן כדי להמחיש את התפרים הגולגולתיים (איור 1C). כוונן את גובה מוט השיניים ומוטות האוזניים כדי למקם את נקודת הלמבדה ונקודת הברגמה באותו גובה (כלומר, עם אותן קואורדינטות ציר z כאשר קצה המחט נוגע בנקודות), כך שהתפר הסגיטלי יהיה אופקי.
7. הנח בעדינות את קצה מחט המזרק של מיקרוליטר (10 מיקרוליטר, 33 גרם) בנקודת הברגמה ואפס את קואורדינטות x, y ו-z ל-0 (איור 1D). העבר את המזרק לאתר ההזרקה (x: 1.04; y: 1.0, כלומר, 1.04 מ"מ לרוחב לקו האמצע ו-1.0 מ"מ אחורי לנקודת הברגמה) בהתאם להנחיית הקריאה הדיגיטלית (איור 1E).
8. קדחו לאט חור קטן דרך הגולגולת באתר ההזרקה מבלי לחדור לדורה עם מחט מזרק של 1 מ"ל (26 גרם, 0.45 מ"מ) (איור 1F). הכניסו לאט את מחט מזרק המיקרוליטר לרקמת המוח דרך החור עד שמגיעים לעומק מסוים (z = -1.62 מ"מ עבור רוב עכברי P56) (איור 1G).
   הערה: מבחינה אמפירית, עומק ההחדרה של -1.62 מ"מ מאפשר לקצה המחט להגיע לאמצע הקורפוס קלוסום של רוב עכברי P56 כך שניתן להעביר את הליזולציטין ישירות לתוך הקורפוס קלוסום כדי לגרום לדמיאלינציה.
9. יש להזריק 1.5 מיקרוליטר של 1% ליזולציטין במהירות של 0.3 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, המתן 5 דקות לפני שתשלוף לאט את מזרק המיקרוליטר כדי למנוע דליפת נוזלים לאורך נתיב מחט ההזרקה.
10. תפר את העור עם 5-0 תפרים כירורגיים (איור 1H).
11. הנח את העכבר על כרית חימום כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. יש לתת זריקה תת עורית של 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן כל 24 שעות כדי להקל על הכאב. מרחו משחת אריתרומיצין על החתך מדי יום כדי להבטיח שהפצע יחלים כראוי. הניחו את העכבר שעבר ניתוח בכלוב לבד והאכילו אותו במזון לח עד להחלמה מלאה. עקוב אחר העכבר מדי יום לאחר הפעולה.

2. הכנת המשאבה האוסמוטית

הערה: מרכיבי המפתח של המשאבה מוצגים באיור 2A.

1. קבע את עומק ההחדרה של צינורית עירוי המוח למוח. ודא שהמחט של צינורית עירוי המוח המשמשת היא באורך 3 מ"מ, וכל מרווח התאמת עומק הוא 0.5 מ"מ. כדי להשיג עומק הזרקה של 1.5 מ"מ (קרוב ליבלסום), חברו שלושה מרווחי כוונון עומק למחט של צינורית עירוי המוח עם דבק רקמות (איור 2B, C).
2. כדי למלא את המשאבה האוסמוטית, חבר את מחט המזרק שמגיעה עם אריזת המשאבה למזרק של 1 מ"ל ושאף את התרופה. החזיקו את המשאבה זקופה, הכניסו את המזרק לתוך הפתח בחלק העליון של המשאבה, והזריקו לאט את התרופה, תוך היזהרות לא ליצור בועות (ראו איור 2D). כאשר הנוזל זורם מהפתח, משוך לאט את המזרק.
3. הסר את האוגן הלבן מווסת הזרימה בעזרת מספריים או צבת, היזהר לא לכופף או לרסק את מנחה הזרימה. לאחר מכן, הכנס את מנחה הזרימה למשאבה (איור 2E). כדי לקבוע אם יש בועות במשאבה האוסמוטית, שקלו את המשאבה האוסמוטית בנפרד לפני ואחרי המילוי.
4. חתוך את הקטטר לאורך מסוים בהתאם לגודל החיה (צנתרים 20-25 מ"מ לעכברי P56 השוקלים כ-25 גרם). חבר את הקטטר לצינורית עירוי המוח.
5. מלאו את הקטטר בתרופות באמצעות המזרק מבלי להכניס אוויר (איור 2F).
6. חבר את הקטטר למנחה הזרימה. לאחר החיבור, ודא שהקטטר מכסה כ-4 מ"מ ממנחה הזרימה החשוף (איור 2G).
7. כדי להבטיח שהמשאבה האוסמוטית תוכל לפעול מיד לאחר ההשתלה, טבלו את המשאבות המלאות במי מלח סטריליים של 0.9% או PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 עד 6 שעות לפחות (רצוי להאריך למשך הלילה) כדי להרטיב מראש את הממברנה החדירה למחצה על פני המשאבה עם תמיסות בעלות לחץ אוסמוטי זהה לסביבת הרקמה (איור 2H).
8. כל הפתרונות הנטענים במשאבות צריכים להיות סטריליים. משאבות ALZET מסופקות סטריליות, לאחר שנחשפו למינון עיקור של קובלט-60. עם זאת, אם מתרחש זיהום חיצוני, ניתן לנקות את פני המשאבה על ידי ניגובה באלכוהול איזופרופיל (70% במים).

3. השתלת המשאבה האוסמוטית

1. המתן 3 ימים לאחר הקמת מודל הדמיאלינציה של קורפוס קלוסום. הפעל את מערכת ההרדמה לבעלי חיים קטנים. חיטוי מספריים, פינצטה וצבת המוסטטית והשרו אותם בתמיסת אלכוהול של 75%. הניחו יריעות סטריליות באזור הניתוח.
2. הרדמו ואבטחו את העכברים על המנגנון הסטריאוטקסי שוב. יש לכסות את פני גלגלי העיניים במשחת עיניים למניעת יובש.
3. יש לחטא את הפצע המקורי ב-75% אלכוהול. פתח את החתך הניתוחי שנתפר קודם לכן (איור 3A) והרחיב את החתך לשכמות (איור 3B).
4. הפרד את העור מרקמת החיבור התת-עורית בעזרת צבת המוסטטית או פינצטה בעצם השכמה כדי לפתוח חלל (איור 3C). הנח את המשאבה האוסמוטית לתוך החלל (איור 3D, E).
5. בעזרת צמר גפן, נגב וחשוף בעדינות את חור הסיכה על פני הגולגולת שנוצר בעת הקמת מודל הדמיאלינציה (ראה שלב 1.8). הכניסו את צינורית עירוי המוח דרך חור הסיכה הזה בניצב, ואבטחו אותה על הגולגולת במהירות באמצעות דבק רקמות (איור 3F).
6. הסירו את הלשונית הניתנת להסרה מעל צינורית עירוי המוח בעזרת מספריים (איור 3G, H). לחלופין, הסר תחילה את הלשונית לפני הכנסת הצינורית כדי למנוע טלטול במהלך תהליך זה.
7. תפר את החתך או חבר אותו עם דבק רקמות (איור 3I).
8. לאחר הניתוח, הנח את העכבר על כרית חימום כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. יש לתת זריקה תת עורית של 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן כל 24 שעות כדי להקל על הכאב. מרחו משחת אריתרומיצין על החתך מדי יום כדי להבטיח שהפצע יחלים כראוי. הניחו את החיה בכלוב לבד והאכילו אותה במזון לח עד להתאוששות מלאה.

תוצאות

איור 1: הקמת מודל עכבר הדמיאלינציה המושרה על ידי ליזולציטין. (A) אבטח את העכבר במנגנון הסטריאוטקסי. (B) פתח חתך באמצע הסגיטלי בגודל 1 ס"מ כדי לחשוף את הגולגולת. (C) דמיינו את התפרים הגולגולתיים. (...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
משאבת אוויר להרדמה	RWD	R510-29	E05818-006
ערכת עירוי מוח 3	ALZET	8851	1-3 מ"מ
קרפרופן	מקלין	C830557-1 גרם	5 מ"ג/ק"ג כל 24 שעות
עין אריתרומיצין משחה	לאורך הטכנולוגיה	YCKJ-RJ-024780	לכסות את פני גלגלי העיניים במהלך ההרדמה
משחת אריתרומיצין	pythonbio	RG180
מכשיר פינוי גז	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lysophosphatidylcholine	Sigma	L0906	להתמוסס ב-1% עם מזרק מיקרוליטר PBS סטרילי
	המילטון	65460-05	סדרת מזרקים: 1700, 10 מיקרוליטר, 33 מד
משאבה מיקרו-אוסמוטית דגם 1002	ALZET	4317	0.25 מיקרוליטר לשעה, 14 ימים
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
נתרן פנטוברביטל	שנחאי Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 מ"ג/ק"ג הזרקה תוך צפקית להמתת חסד
מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים	RWD	R520IE	E05807-006 M
ציוד סטריאוטקסי	RWD	E06382
STERI 250 סטריליזטור	קלר	31101	עיקור מהיר של מכשירים כירורגיים
תפרים כירורגיים	שנחאי jinhuan	F504	5-0
מחט מזרק (1 מ"ל)	שנחאי KDL	6930197811018	26 מד (0.45 מ"מ x 16 מ"מ)
בדיקת תרופה וממס	מערכת ניטור הומותרמית תלויה בניסוי	N/A
Thermostar	RWD	69026	שמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההרדמה
דבק רקמות Vetbond	3M	1469SB	אבטח את צינורית עירוי המוח, והדבק את חתך העור