אספקה תוך-תקלית של תרכובת בדיקה למערכת העצבים המרכזית של החולדה

תקציר

מקור: Chen, Y., et al. אספקה תוך-תקלית של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס במערכת העצבים המרכזית של החולדה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את העברת תרכובת הבדיקה לנוזל המוח השדרתי (CSF) דרך קטטר המושתל בעמוד השדרה המותני של מודל חולדה. התרכובת מסתובבת לאורך ה- CSF למוח ולחוט השדרה, נכנסת לתאי עצב ומציעה פוטנציאל טיפולי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. ניתוח

1. עם החולדה הנתמכת על ידי צינור חרוטי של 50 מ"ל, זהה את שני הבורות הטבעיים בין השרירים מעל האגן (חיצים באיור 1A). כשיד אחת מחזיקה את הבורות האלה, השתמש ביד השנייה כדי ללחוץ בעדינות ולהרגיש את עמוד השדרה מכיוון הזנב לכיוון הרוסטרלי ולמצוא את השקע הגדול הראשון בין החוליות, וזהו המרווח הבין חולייתי בין חוליות העצה 1 (S1) וחוליה מותנית 6 (L6) (איור 1B).
2. זוז מעט בתנועה כדי לזהות את השקע הבא, את המרווח הבין חולייתי בין החוליות המותניות 5 (L5) ו-L6, ואת אתר ההזרקה (* באיור 1A). השתמש באזמל כדי לבצע חתך באורך של לא יותר מ-2 ס"מ בעור לאורך קו האמצע מרוסטרל לזנב כך שאתר ההזרקה יהיה במרכז החתך (קו מקווקו באיור 1A).
3. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לנתח את רקמת החיבור כדי לדמיין את שכבת השריר. לאחר מכן, בצע חתך של 1 ס"מ בקפסולת השריר מיד לרוחב לתהליך עמוד השדרה הגבי של החוליה המותנית L6.
   הערה: ניתן היה לדמיין את עצמות החוליה המותנית L6 בשלב זה.
4. מקם את מכלול מחט הצינורית המנחה ליד ההיבט הקדמי של החוליה המותנית השישית ודחף אותו לחלל הבין חולייתי לאורך ההיבט הקדמי של החוליה השישית כך שקצה המחט יחדור לתעלת עמוד השדרה. דחוף את צינורית ההנחיה למקומה לאורך המחט והסר את מחט ה-23-G, והשאיר רק את צינורית ההנחיה במקומה.
   הערה: כדאי להשתמש במלקחיים קהים כדי לאתר את התהליך הגבי של החוליה המותנית L6 לפני החדרת המחט. באופן כללי, ניתן לראות נוזל נוזל מוחי (CSF) נכנס לרכזת המחט (נוזל זה עשוי להיות צבוע ברמז של דם, אך זה לא מצביע על כך שנגרם נזק או שהמחט לא ממוקמת כהלכה). המחברים לא ראו כמות גדולה של דם או דימום חמור במהלך הליך זה. אם אחד מהם קורה, יש לפנות לווטרינר כדי לקבוע את הטיפול המתאים והאם יש להמית בעלי חיים.
5. הכנס את מכלול חוט הקטטר לתוך צינורית ההנחיה. זווית כלפי מטה של מכלול חוט הצנתר בזווית של כ-45 מעלות לתעלת עמוד השדרה ודחף את הקצה כ-0.3 ס"מ לתוך תעלת עמוד השדרה.
6. הסר את צינורית ההנחיה והשאיר את הקטטר עם חוט הסטילט במקומו. הסר את חוט הסטילט כ-2.5 ס"מ מהקצה התוך-תקלי של הצנתר וקדם את הקטטר לתוך תעלת עמוד השדרה עד שסימן 2 ס"מ נמצא בכניסה לתעלה (נראה ממש מתחת לשריר), כפי שמוצג באיור 2Bvi.
   הערה: הצנתר המוחדר צריך להימשך בצורה גברית לתוך החלל התת-עכבישי. מיקום מוצלח אמור לאפשר לצנתר לנוע בחופשיות בחלל זה.
7. משוך לחלוטין את חוט הסטילט, וניתן לראות CSF נכנס לצנתר המושתל.
8. חבר את מכלול קטטר המסירה לקצה הדיסטלי של הצנתר המושתל דרך קצה המחט 30 G (איור 2Bv, vi).
9. טען 60 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים למזרק של 100 מיקרוליטר (מזרק שטיפה). טען בולוס של 30 מיקרוליטר מתרכובת הבדיקה (למשל, אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס או תמיסת ASO) למזרק שני (מזרק הזרקה).
10. חבר את מזרק השטיפה (עמוס במי מלח) לקצה מתאם הצינור של מכלול קטטר המסירה (איור 2Bv). הזריק 20 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים לחלל התוך-תקלי (שטיפה לפני ההזרקה).
11. חבר את מזרק ההזרקה (טעון בתרכובת בדיקה) לקצה מתאם הצינור של מכלול צנתר המסירה (איור 2Bv). הזרקו 30 מיקרוליטר של תרכובת בדיקה לחלל התוך-תקלי מעל 30 שניות.
    הערה: נפח ההזרקה השגרתי של ASO הוא 30 מיקרוליטר כדי להשיג נוקדאון טוב בחוט השדרה ובקליפת המוח. דווח כי נפחי ההזרקה עשויים להשפיע על הפצת התרכובת, אם כי נפחי הזרקה שונים לא נבדקו. אם נעשה שימוש בתרכובת או בנפח אחר, יש לקבוע אמפירית את הבטיחות והיעילות.
12. חזור על שלב 1.10 ושטוף את הקטטר עם עוד 40 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים (שטיפה לאחר ההזרקה). לאחר מכן נתק את מכלול קטטר המסירה מהצנתר המושתל.
    הערה: השטיפה לפני ואחרי ההזרקה נחשבת כמפחיתה את הקיבוע המקומי של התרכובות ומשפרת את פיזורן למבנים הרוסטרליים.
13. כדי לחתוך ולאטום בחום את הצנתר המושתל, הנח זוג מלקחיים סטריליים במעקר חרוזים עד שהם חמים מאוד, ולאחר מכן הדקו את הצינור עם הקצה החם של המלקחיים.
    הערה: פעולה זו ממיסה את הקטטר. לפיכך, החור בצינור קורס, וכל הצדדים נדבקים זה לזה, ואוטמים את הצינור בצורה אספטית. לאחר מכן, הוא ממוקם בחלל התת עורי.
14. השתמש בתפרי מונופילמנט נספגים כדי להדק את הצנתר האטום בחום שנותר לרקמת החיבור. לאחר מכן, השתמש בתפרי מונופילמנט שאינם נספגים כדי לסגור את העור מעל הצנתר המאובטח האטום בחום.
    הערה: ניתן להשתמש בקליפסים לפצעים גם כפי שאושר על ידי פרוטוקול הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). הטכניקה תואמת להזרקות חוזרות, אם כי היא שימשה רק להזרקות חד פעמיות בידינו. יש להעריך אמפירית את ההיתכנות של זריקות חוזרות באישור ה-IACUC.
15. השתמש בגזה ובמי מלח כדי לשטוף את כל הדם מהעור ולאפשר לבעל החיים להתאושש מההרדמה באינקובטור מחומם עד לניידות, ואז הוא מוחזר לכלוב הביתי שלו (שתי חולדות בכלוב).
    הערה: בעת ביצוע ניתוחים במספר חולדות באותו יום, יש לנקות כלים באמצעות מים כדי להסיר את הדם ולעקר מחדש באמצעות מעקר חרוזים יבש מחומם (למשך 20 שניות לפחות, עם זמן להתקרר) בין בעלי חיים. סט חדש של כלים משמש לכל 5 בעלי חיים.
16. עקוב אחר בעלי החיים מדי יום לפחות 3 ימים לאחר הניתוח והמשך לעקוב אחריהם מדי שבוע לאחר הניתוח, על פי פרוטוקול IACUC.

תוצאות

איור 1: זיהוי אתר ההזרקה וקו החתך. (A) כאשר הבטן של החולדה נתמכת על ידי צינור חרוטי של 50 מ"ל, שני הבורות בין השרירים שמעל האגן נראים בקלות (חיצים). (B) כשיד אחת מחזיקה את הבורות, השתמשו ביד השנייה כדי ללחוץ בעדינות ולהרגיש את עמוד השדרה ולמצוא את המרווח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BD צינורות PE תוך-רפואיים	BD	צינורות פוליאתילן PE50, קוטר 0.023 ב-BD	427400 (10 רגל, Fischer Scientific 22-204008) או 427401 (100 רגל, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD צינורות PE תוך-רפואיים	BD	צינורות פוליאתילן PE10, קוטר 0.011 אינץ	BD 427410 (10 רגל, פישר סיינטיפיק 14-170-11B) או 4274011 (100 רגל, פישר סיינטיפיק 14-170-12B)
BD PrecisionGlide מחטים חד פעמיות 30G	BD		BD
מדריך צינורית	BD	19G x 1 WT (1.1 מ"מ x 25 מ"מ) מחט	BD 305186
מזרק המילטון 100 ul	חברת המילטון	מזרק המילטון 100 ul
מעקר חרוזים חם	בסדר כלי		מעקר מודל מס. FST 250
קרצוף פובידון	PDI		S48050
מי מלח	בקסטר	נתרן כלורי 0.9% עירוי תוך ורידי BP 50 מ"ל	FE1306G
	אזמל נוצות	אזמל חד פעמי	מס' 10
כרית חימום לבעלי חיים קטנים	K&H ייצור		דגם מס' 1060
חוט סטילט	מקמאסטר-קאר	1749T14	LH-36233780
וילון מגבת ניתוח	Dynarex		4410
מספריים ומלקחיים כירורגיים	FST ו-Fisher Scientific
Setures	Ethicon		4-0 או 5-0
מקור חלופי לחומרים מוכנים מראש ומעוקרים להליך
קטטר מינון מערכת	מערכות עירוי		RIDC-01
מדריך צינורית	SAI מערכות		RIDC-GCA
צנתרים פנימיים	מערכות עירוי SAI	RIDC-INC
חוט סטיילט		עירוי SAI	RIDC-STY

' 305128 מדע זה SAI עירוי מערכות