הערכת טיפול בפלזמה בלחץ אטמוספרי בתאי נוירובלסטומה חסרי גלוקוז

תקציר

מקור: Yan, X., et al., יישום חדש של סילון פלזמה בלחץ אטמוספרי כחומר מגן עצבי מפני פגיעה הנגרמת על ידי חסך גלוקוז של תאי SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון מדגים את הפעילות הנוירו-פרוטקטיבית של טיפול בפלזמה בלחץ אטמוספרי במינון נמוך בתאי נוירובלסטומה נטולי גלוקוז על ידי ויסות מתח חמצוני ושיפור כדאיות התאים.

פרוטוקול

1. טיפול APPJ (סילון פלזמה בלחץ אטמוספרי) של SH-SY5Y

1. התאם את המרחק בין הזרבובית של צינור הקוורץ לפלטפורמה שבה תוצב צלחת 96 הבארות ל-3 ס"מ. ודא שהקרן יכולה לגעת במשטח מדיום התרבות.
   הערה: המרחק אינו נמדד מתחתית הצלחת. הוא מותאם תחילה ל -3 ס"מ בין הזרבובית של צינור הקוורץ לפלטפורמה המשמשת להצבת צלחת 96 הבארות.
2. לפני הטיפול ב-APPJ (סילון פלזמה בלחץ אטמוספרי), שנה את מדיום התרבות בכל באר למעט בארות הבקרה ל-RPMI 1640 ללא מדיום גלוקוז.
3. הנח את הצלחת מתחת לפיית ה-APPJ וודא שהסילונים יכולים לירות אנכית לתוך כל באר.
4. טפל בתאים בבארות נפרדות עם APPJ עבור 0 שניות, 1 שניות, 2 שניות, 4 שניות, 8 שניות ו-12 שניות
   הערה: APPJ נוצר על ידי הליום מיינן (איור 1). התאים שנפגעו ממחסור בגלוקוז מטופלים על ידי זרימת הליום של 4 שניות ו-8 שניות כדי למנוע את השפעות ההליום על התאים. יש לבצע את כל הטיפולים בשלוש עותקים.

2. בדיקת כדאיות תא

הערה: אל תשנה את המדיום בשלב זה.

1. לאחר הטיפול ב-APPJ, דגרו את התאים למשך שעה אחת בחממת תאים.
2. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) לכל באר.
3. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות
   הערה: קו התאים SH-SY5Y רגיש לתנאי מחסור בגלוקוז. כדאיות התאים יורדת לכמעט 50% לאחר שעה אחת של מחסור בגלוקוז, שהוא תנאי הכדאיות האופטימלי של התא למחקרי פרמקודינמיקה. ל-CCK-8 אין ציטוטוקסיות לתאים, והתאים מודגרים עם מגיב CCK-8 למשך 4 שעות נוספות בתנאי מחסור בגלוקוז לאחר טיפול ב-APPJ כדי לבדוק את כדאיות התאים. לאחר 8 שעות של מחסור בגלוקוז וטיפול ב-APPJ, ההשפעה המגנה של APPJ הופחתה משמעותית מכיוון שמשך הזמן הארוך של מחסור בגלוקוז הוביל לנזק חמור לתאי SH-SY5Y. לא הייתה עדות לתאים חיים לאחר 24 שעות של מחסור בגלוקוז.
4. מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר עם קורא מיקרו-פלטות.

תוצאות

איור 1: תגובות RNS (מיני חנקן תגובתיים) ו-ROS (מיני חמצן תגובתיים) אופייניות בפליטות APPJ (סילון פלזמה בלחץ אטמוספרי).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SH-SY5Y קו תאים	סין המרכז לאוסף תרביות סוג	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 בינוני	Thermo Scientific	21875091	מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס
RPMI 1640 בינוני ללא גלוקוז	תרמו Scientific	11879020	מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס
סרום עגל עוברי	תרמו סיינטיפיק	16000044	מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס
96 בארות צלחת	קורנינג	3599
ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8)	מעבדות Dojindo	CK04	מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס
קורא מיקרו-פלטות	Tecan	M200 Pro	למדידת הספיגה ב-450 ננומטר
מתח גבוה מגבר הספק	Trek	PD06087	להגברת פונקציית הכוח
מחולל אותות	MaZe Electronics Science and Technology	AT30120	למתן האות הספציפי
מתח גבוה	Tektronix	P6015A	לגילוי
מתח גבוה אוסילוסקופ דיגיטלי	Tektronix	DPO4104B	להצגת האות

בדיקה