אספקה תוך-אפית של siRNA למוח העכבר באמצעות מכשיר מיקום

תקציר

מקור: Ullah, I., et.al. מכשיר מיקום למיקום עכברים במהלך העברת siRNA תוך-אף למערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים טכניקת מתן תוך-אף מדויקת להעברת קומפלקסים של פפטיד-siRNA המכוונים לתאי עצב למוח העכבר באמצעות מכשיר מיקום מיוחד. עכברים מורדמים מאובטחים במצב ראש למטה וקדימה כדי לייעל את שאיפת ה-siRNA תוך מניעת ניקוז ריאות. פפטיד המטרה מקל על ספיגה מתווכת קולטנים בנוירונים, ומאפשר העברת siRNA ממוקדת והשתקת גנים במוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. מיקום עכבר

1. העריכו את רמת ההרדמה על ידי רפלקס דוושה (צביטת בוהן מוצקה) כדי לשמור על המישור הניתוחי.

2. מקם את התקן המיקום במרחק ובגובה מתאימים כדי לספק גישה נוחה לכל הריאגנטים הנדרשים.

3. לאחר שהעכברים מורדמים כראוי, הרם בעדינות כל עכבר בעורפו עם האגודל והאצבע המצביעה והנח אותו על הכיסא המיועד.

4. מיקום נכון של העכבר על הכיסא חשוב מאוד בשלב זה. הנח את גב העכבר במקביל למשענת האחורית של הכיסא, וב-90 מעלות למושב הכיסא. הרימו את הידיים מהעכבר ותנו לחיה לשכב באופן טבעי בתנוחת הראש למטה וקדימה, בלי לדחוף או ללחוץ, כפי שמוצג באיור 1B. ודא שהגפיים הקדמיות של העכבר מספקות תמיכה טבעית בזמן שהחיה נמצאת בתנוחה רגועה זו, ללא כל אי נוחות לעכבר.

5. לאחר שהעכברים ממוקמים כראוי, חגרו את העכברים בחגורת הכיסא, והתחילו מיד בחיסון התוך-אף.

2. משלוח תוך-אף (IN)

הערה: פרוטוקול זה מתאר את אספקת ה-IN של מתחמי RVG9R:siRNA באמצעות מכשיר המיקום של העכבר. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לתת בקלות מקסימום 20-30 מיקרוליטר של תמיסה לכל עכבר בטיפות של 2 מיקרוליטר. נפח זה נמוך מזה של חלל האף של העכבר, שהוא 0.032 ס"מ³, כך שההליך אינו גורם לחסימת נחיריים קטלנית או לחנק. פרוטוקול זה מאפשר חיסון בו זמנית של לפחות ארבעה עכברים ומקסימום שמונה עכברים לכל מכשיר, וכתוצאה מכך אופטימיזציה של הזמן והפחתת השונות.

1. קח את המיקרו-פיפטה של 10 מיקרוליטר והתאם אותה ל-2 מיקרוליטר.

2. טען את המיקרופיפטה עם 2 מיקרוליטר של תמיסה מרוכבת RVG9R:siRNA (למשל, 5.2 מיקרוגרם של siCy5 מורכב עם 104 מיקרוגרם של RVG9R לניסוי המסירה, ו-13.5 מיקרוגרם של siSOD1 מורכב עם 270 מיקרוגרם של RVG9R לניסוי ההשתקה, בנפח סופי של 25 מיקרוליטר של PBS המכיל 5% גלוקוז.

3. תוך כדי החזקת הפיפטה ביד הדומיננטית, התאם את המיקום על ידי הנחת מרפק על משטח הספסל. תמכו ביד המחזיקה את הפיפטה ביד השנייה כדי למנוע תנועות בלתי נשלטות בזמן מתן הפיפטה.

4. הניחו טיפה של ~2 מיקרוליטר קרוב מאוד לנחיר אחד כך שהעכבר יוכל לשאוף ישירות את הטיפה (ראו איור 1B). אם לא נוצרת טיפה זעירה בקלות, החלף את קצה הפיפטה בחדש וחזור על הפעולה. השתמש בשעון העצר כדי לאמת את מרווח הזמן בין החיסונים.

5. מכשיר זה מאפשר טיפול בארבעה עכברים לפחות בכל פעם. אם נדרשת קבוצה נוספת של עכברים לחזור על שלב 2.4, הגדר סרגל נוסף עם ארבעה כיסאות מעל או מתחת לסרגל הראשון עם ארבעה כיסאות כדי להכיל עד שמונה עכברים בכל פעם במכשיר.

6. חזור על שלב 2.4 עם הנחיר השני לאחר 3-4 דקות מהחיסון הראשון. מרווח זמן זה מספיק לעכבר כדי להשלים את שאיפת המנה הראשונה ולהחזיר את הנשימה התקינה. אם טיפה של התמיסה הנשאפת נעקרת עקב נחירה מקרית מהנאריס של העכבר, יש לחסן מחדש 2 מיקרוליטר נוספים של תמיסה.

7. חזור על כל התהליך עם נחיריים חלופיים עד לסיום המינון של 20-30 מיקרוליטר. ייקח ~30-45 דקות להשלים את כל הליך החיסון.

8. מרחו משחה רטובה על עיני העכברים לפני החזרת העכברים לכלובים המיועדים להם.
הערה: אין להשאיר את העכברים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על עצם החזה.

תוצאות

איור 1: הצגה מצולמת של הליך החיסון IN באמצעות מכשיר המיקום. (א) ציוד ניסיוני הנדרש לחיסון IN. (B) חיות בתנוחת ראש למטה וקדימה שיושבות על המכשיר (משמאל) ושקיעה של טיפה של 2 מיקרוליטר לחיסון IN (מימין).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זן
Balb/c	Orient Bio	N/A	בן 6-8 שבועות
			פפטידים
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRR
תוכנה, אלגוריתמים והתקנים
מכשיר מיקום עכבר	Signet Biotech	N/A
אוליגונוקלאוטידים ופריימרים
siSOD1	ST Pharm	N/A	תחושה: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
פריימרים	ST Pharm	N/A	F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'

עכבר, 20-30 גרם