בידוד וטיהור של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים רקומביננטיים של מיאלין

תקציר

מקור: Jain, R. W., et al. ייצור וטיהור פשוט ויעיל של גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של מיאלין עכבר למחקרי אנצפלומיאליטיס אוטואימוניים ניסיוניים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיהור של MOGtag, גליקופרוטאין מיאלין רקומביננטי אוליגודנדרוציטים (MOG) המשמש במחקרי דלקת מוח אוטואימונית ניסיוניים (EAE). הפרוטוקול כולל ליזה חיידקית, סוניקציה, צנטריפוגה וכרומטוגרפיה של זיקה לניקל כדי להשיג MOGtag מטוהר. חלבון זה מאפשר מחקר אוטואימוני בתיווך תאי B במודלים של טרשת נפוצה.

פרוטוקול

1. קצירת חלבון MOGtag

הערה: בשלב זה, החיידקים ייצרו כמויות גדולות של חלבון MOGtag. כדי לקצור MOGtag, חיידקים עוברים תחילה ליזה במאגר Triton X-100, ולאחר מכן סוניקציה. לאחר מכן MOGtag משתחרר מגופי הכללה ועובר דנטורציה עם אימידזול וגואנידין, וכתוצאה מכך תמיסת חלבון גולמית המכילה את חלבון MOGtag.

1. קח מנה אחת של 1 מ"ל מאחת מתרביות הלילה והעביר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. גלולה את התאים ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט. סמן את הצינור TO/N (לאחר אינדוקציה), ולאחר מכן הכניס את גלולת החיידקים למקפיא של -20 מעלות צלזיוס עבור ניתוח דפי SDS עתידי (איור 2).
2. פזרו את התרביות באופן שווה בין בקבוקי 250 מ"ל התואמים לצנטריפוגה במהירות גבוהה ושמרו אותם על הקרח מנקודה זו ואילך. גלולה את תאי החיידקים ב-22,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
3. השליכו את הסופרנטנט. אחסן את כדורי החיידקים ב-20 מעלות צלזיוס או המשך לשלב 1.4.
4. הכן מאגר ליזה (0.1 מ"ג/מ"ל ליזוזים ביצת תרנגולת, 0.1% טריטון-X (v/v) במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS)) על ידי הוספת 60 מיקרוליטר של טריטון X-100 ו-120 מיקרוליטר של 50 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי ליזוזים של ביצת תרנגולת ל-60 מ"ל של PBS.
5. השעו מחדש ושלבו את כל כדורי החיידקים משלב 1.3 בסך הכל 30 מ"ל של מאגר ליזה. העבירו את הנפח הזה לצינור עגול תחתון של 50 מ"ל המסוגל לצנטריפוגה במהירות גבוהה. יש להניח את השפופרת באמבט מים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך זמן הדגירה, נער את הצינור פעמיים כדי להשעות מחדש את התאים.
6. לאחר הדגירה, העבירו את הצינור על הקרח והפכו את התמיסה לסוניקציה ב-20 קילו-הרץ, משרעת 70%, דופק למשך 3 שניות, דופק למשך 3 שניות וחמישה פולסים לכל סיבוב. סוניקציה של התמיסה במשך שישה סבבים בסך הכל ואפשר לתמיסה להתקרר על קרח בין הסיבובים.
7. צנטריפוגה את התמיסה ב-24,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על שלבים 1.5-1.7 פעם אחת. אחסן את הגלולה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או המשך לשלב 1.8.
8. הכן מאגר A (500 מ"מ NaCl (נתרן כלורי), 20 מ"מ Tris-HCl (טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד), 5 מ"מ אימידזול, pH 7.9) על ידי הוספת 0.8766 גרם NaCl, 0.09456 גרם Tris-HCl ו-0.01021 גרם אימידזול לכוס של 100 מ"ל. מוסיפים מים עד שהנפח מגיע ל-28 מ"ל, ואז מכוונים את ה-pH של התמיסה ל-7.9. לאחר מכן, העבירו את התמיסה לגליל מדורג של 100 מ"ל והוסיפו מים עד לנפח 30 מ"ל.
9. השעו מחדש את הגלולה משלב 1.7 ב-30 מ"ל של מאגר A ודגרו על תמיסה זו ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. במהלך תקופה זו, שקלו 17.2 גרם גואנידין-HCl.
10. סוניקציה של התמיסה על קרח באמצעות אותן הגדרות כמו בשלב 1.6. לאחר מכן הוסף 17.2 גרם גואנידין-HCl לתמיסה. דגרו אותו על קרח למשך שעה אחת כדי להמיס את חלבון ה-MOGtag.
11. צנטריפוגה את התמיסה ב-24,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט ומאחסנים את הסופרנטנט ב-4 מעלות צלזיוס עד לטיהור החלבון.

2. טיהור חלבון

הערה: בשלבים הבאים, חלבון ה-MOGtag יטוהר באמצעות 4 סבבי ספיגה על שרף ניקל טעון (באמצעות ה-His-tag) ופליטה.

1. צור את המאגרים הבאים:
   1. הכן מאגר B (500 מ"מ NaCl, 20 מ"מ Tris-HCl, 5 מ"מ אימידזול, 6 מ' גואנידין-HCl, pH 7.9). הוסף 5.844 גרם NaCl, 0.6304 גרם Tris-HCl, 0.0681 גרם אימידזול ו-114.64 גרם גואנידין-HCl לכוס של 500 מ"ל. לאחר מכן מוסיפים מים עד שהם מגיעים ל -190 מ"ל ומכוונים את ה- pH ל -7.9. מעבירים את התמיסה לגליל מדורג של 250 מ"ל ומוסיפים מים עד לנפח 200 מ"ל.
   2. הכן מאגר אלוטיון (500 מ"מ NaCl, 20 מ"מ Tris-HCl, 0.5 מ' אימידזול, 6 מ' גואנידין-HCl, pH 7.9). הוסף 5.844 גרם NaCl, 0.6304 גרם Tris-HCl, 6.808 גרם אימידזול ו-114.64 גרם גואנידין-HCl לכוס של 500 מ"ל. מוסיפים מים עד שהם מגיעים ל -190 מ"ל ומכוונים את ה- pH ל -7.9. מעבירים את התמיסה לגליל מדורג של 250 מ"ל ומוסיפים מים עד לנפח 200 מ"ל.
   3. הכן מאגר רצועה (500 מ"מ NaCl, 20 מ"מ Tris-HCl, 100 מ"מ EDTA (חומצה טטראצטית אתילן דיאמין), pH 7.9). הוסף 5.844 גרם NaCl, 0.6304 גרם Tris-HCl, 40 מ"ל 500 מ"מ EDTA לכוס של 500 מ"ל. מוסיפים מים עד שהם מגיעים ל-190 מ"ל ומכוונים את ה-pH ל-7.9. מעבירים את התמיסה לגליל מדורג של 250 מ"ל ומוסיפים מים עד לנפח 200 מ"ל.
   4. הכן מאגר מטען (0.1 מ' ניקל גופרתי). הוסף 5.257 גרם ניקל גופרתי לכוס של 500 מ"ל והוסף מים עד שהוא מגיע ל-190 מ"ל (זהירות, אין לטפל בניקל גופרתי מחוץ למכסה אדים עד שהניקל גופרתי מומס במים). לאחר שהניקל גופרתי התמוסס, העבירו את התמיסה לגליל מדורג של 250 מ"ל והוסיפו מים עד שהנפח מגיע ל-200 מ"ל.
2. פצלו 10 מ"ל של שרף ניקל בין שני צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מ"ל המסוגלים לעמוד בכוחות צנטריפוגליים מעל 4,500 x גרם (5 מ"ל בכל צינור).
3. טען ואזן את שרף הניקל:
   1. שטפו את השרף על ידי הוספת 40 מ"ל מים לכל צינור המכיל את השרף. הניחו את הצינורות בצורה אופקית על נדנדה ותנו להם להתסיס במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הסיום, צנטריפוגה את הצינורות ב-4,500 x גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   2. השליכו את הסופרנטנט על ידי פיפטינג כדי למנוע הפרעה לגלולה. הוסף 40 מ"ל של מאגר מטען לכל צינור. מעבירים את הצינורות על נדנדה ונותנים להם להתערבב במשך 15 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הסיום, צנטריפוגה את הצינורות ב-4,500 x גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. השליכו את הסופרנטנט, ואז הוסיפו 40 מ"ל של מאגר B לשינורות. מעבירים את הצינורות על נדנדה ונותנים להם לערבב במשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר שתסיים, צנטריפוגה את הצינורות ב-4,500 x גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופרנטנטים.
4. אופציונלי: קח 150 מיקרוליטר מהחלבון המסיס שנאסף בשלב 1.11 והעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. סמן את הצינור כקדם-דגירה והקפיא אותו ב-20 מעלות צלזיוס לניתוח דף SDS (נתרן דודציל סולפט) עתידי (איור 2, MOGtag גולמי).
5. טהר את חלבון MOGtag:
   1. העבירו את כל נפח החלבון המסיס משלב 1.11 (~40 מ"ל, פחות הדגימה הקטנה שהוסרה בשלב 2.4) לצינור הראשון (איור 1, צינור 1) המכיל שרף ניקל משלב 2.3, ערבבו והניחו אופקית על נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   2. צנטריפוגה את הצינור ב-4,500 x גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שתסיים, העבירו את הסופרנטנט לצינור השני (איור 1, שפופרת 2) של שרף ניקל ודגרו כפי שתואר בשלב הקודם. בינתיים, המשיכו עם שלבים 3 עד 6 למטה עם שפופרת 1.
   3. השעו מחדש את שרף הניקל בצינור 1 ב-40 מ"ל של מאגר פליטה והניחו את הצינור אופקית על נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-4,500 x גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. העבירו את הסופרנטנט המכיל חלבון MOGtag לבקבוק של 250 מ"ל שכותרתו 'חלבון MOGtag מטוהר' ושמרו על בקבוק זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בכל שלב של השטיפה, אסוף את הסופרנטנט שנוצר בבקבוק זה.
   5. הוסף 40 מ"ל של מאגר רצועות לשרף הניקל והניח אופקית על נדנדה למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   6. צנטריפוגה את הצינור ב-4,500 x גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, ולאחר מכן טענו מחדש את שרף הניקל כמפורט בשלב 2.3.
   7. לאחר שתסיים, התקדם עם הצינור השני כמפורט בשלב 2.5. בסך הכל 4 סבבים של ספיגה של החלבון המסיס משלב 1.11 על שרף הניקל הטעון והפליטה ישחזרו את רוב החלבון, אם כי, אם תרצה, ניתן לשחזר חלבון נוסף בסבבים נוספים של ספיגה ופליטה.
6. לאחר השלמת ארבעה (או יותר) סבבים של ספיגה ופליטה, יש לאחסן את החלבון המטוהר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ניתן לאחסן שרף ניקל ב-40 מ"ל של תמיסת אתנול 20% ב-4 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בו שוב.

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של השלבים הנדרשים לייצור חלבון MOGtag טהור. כדי ליצור את חלבון ה-MOGtag, חיידקים המבטאים את חלבון ה-MOGtag גדלים לצפיפות גבוהה ולאחר מכן מושרים לבטא MOGtag באמצעות IPTG כמפורט בסעיף 1. לאחר תרבית לילה, החי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		חיידקים אלה נדרשים לייצור חלבון MOGtag. מלאי גליצרול של חיידקים אלה זמין לפי בקשה.
טחנת מרק LB	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	Bio Basic	AB0028	יש להרכיב מחדש את האבקה ל-50% אתנול/50% H₂O ב-100 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	החזר את האבקה ל-H₂O ב-1M ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
ליזוזים ביצת עוף	ביושופ	LYS702.10	להרכיב מחדש ב-H₂O ב-50 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
Triton-X100	Sigma	T-8532
תמיסת מלח חוצצת פוספט	טכנולוגיות חיים	20012-027	צורך במי מלח חוצץ פוספט מסחריים, כל תמיסת מלח חוצצת פוספט מתוצרת מעבדה סטנדרטית מספיקה.
נתרן כלורי	ביושופ	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	האיכות חייבת להיות גבוהה מ-98% טוהר.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
ניקל (II) סולפט	Bioshop	NIC700.500
שרף הכריכה שלו	EMD Millipore	69670-3	אחסן ב-20% אתנול 80% H₂O ב-4 מעלות צלזיוס
אתנול נטול מים	אלכוהולים מסחריים	P016EAAN	לדלל במים לפי הצורך.
חומצה אצטית קרחונית	Bioshop	ACE222.1
נתרן אצטט טריהידרט	Bioshop	SAA305.500
סרום בקר אלבומין סטנדרטי	bio-rad	500-0206
חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, מלח דיסודיום דיהידרט	פישר מדעי	BP120-500
פוליאתילן גליקול 3350	ביושופ	PEG335.1
פוליאתילן גליקול 8000	ביושופ	PEG800.1
סוניקטור	פישר מדעי	FB-120-110
נתרן דודציל סולפט	ביושופ	SDS001

אין