ויסות צמיחת תאי שוואן במבחנה באמצעות טכניקת שדה חשמלי פועם ננו-שניות

תקציר

מקור: Han, J., et.al. ויסות צמיחת תאי שוואן על ידי שדה חשמלי פועם ננו-שניות להתחדשות עצבים היקפיים במבחנה. J. Vis. Exp. (2024)

סרטון זה מדגים את היישום של טכניקת השדה החשמלי הפועם של ננו-שניות (nsPEF) כדי לווסת את צמיחת תאי שוואן (SC). הפולסים החשמליים המהירים גורמים לננו-נקבוביות חולפות בממברנות SC, מה שמקל על זרימת סידן המפעילה מסלולי איתות המניעים התפשטות SC, דה-דיפרנציאציה והפרשת גורמים נוירוטרופיים. תגובות תאיות אלו משפרות את התמיכה האקסונלית, הישרדות עצבית ומיאלינציה פוטנציאלית, ומדגישות את nsPEF ככלי מבטיח לתיקון עצבים.

פרוטוקול

1. הפשרה של תאי RSC96 שמורים בהקפאה

1. הפשירו את הקריוביאל המכיל 1 מ"ל של תרחיף תאים על ידי ניעורו המהיר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוסיפו אותו לצינור צנטריפוגה המכיל 4-6 מ"ל של מדיום תרבית שלם וערבבו היטב.
2. צנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך 3-5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-3 מ"ל של מדיום תרבית שלם.
3. מוסיפים את תרחיף התאים לבקבוק תרבית (או צלחת) המכיל 6-8 מ"ל של מדיום תרבית שלם ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. למחרת, התבוננו בצמיחת התא ובצפיפות תחת מיקרוסקופ.

2. מעבר תאים:

הערה: אם צפיפות התאים מגיעה ל 80% -90%, הוא מוכן למעבר.

1. השליכו את מדיום התרבות ושטפו את התאים 1-2 פעמים עם מי מלח חוצץ פוספט (PBS) ללא יוני סידן ומגנזיום.
2. הוסף 0.25% (w/v) טריפסין-0.53 מ"מ EDTA לבקבוק התרבית (1-2 מ"ל לבקבוק T25, 2-3 מ"ל לבקבוק T75) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות.
3. התבונן בניתוק התא תחת מיקרוסקופ. אם רוב התאים הופכים עגולים ומתנתקים, החזר במהירות את הבקבוק לאזור העבודה, הקש בעדינות על הבקבוק והוסף 3-4 מ"ל של מדיום תרבית המכיל 10% FBS כדי לעצור את העיכול.
4. מערבבים את התוכן, שואבים את התמיסה וצנטריפוגה בחום של 1000 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים על ידי הוספת 1-2 מ"ל של תרבית טרייה ופיפטינג בעדינות.
5. העבירו את מתלה התאים לבקבוק T25 חדש ביחס של 1:2 והוסיפו 7 מ"ל של מדיום תרבית.

3. הפעלת מכשיר nsPEF

1. השעו מחדש את תאי ה-RSC96 ב-1 מ"ל של מדיום תרבית DMEM והעבירו אותם לצלחות קולורימטריות עם אלקטרודות משני הצדדים.
2. הפעל את מתג ההפעלה.
3. התאם את הפרמטרים על ידי סיבוב הכפתור במכשיר כדי לשנות את עוצמת השדה החשמלי. העוצמות שנקבעו במחקר זה הן 5 קילו וולט/ס"מ, 10 קילו וולט/ס"מ, 20 קילו וולט/ס"מ ו-40 קילו וולט/ס"מ.
4. סובב בזהירות את האלקטרודות עד להופעת ניצוצות, מה שמאפשר לתאים לקבל 5 פולסים של nsPEF בהתאם לעוצמות עוצמת השדה שנקבעו מראש לפני הפרדה מיידית של שתי האלקטרודות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כוח מתח גבוה עבור nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
פיפטה	ווהאן Xavier ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ
RSC96 תאי שוואן	ווהאן Xavier ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
כבל מיוחד עבור nsPEF	Times מערכות מיקרוגל	M17/78-RG217

ספק